植物研究进展论文.doc

研究生课程论文题目: PCR-DGGE 在真菌研究中的应用学院生命科学学院课程名称植物学科研究进展专业年级植物学 2014 级学号 20141069 姓名成斌 2015 年1月 20日 PCR-DGGE 在真菌研究中的应用成斌(河北大学生命科学学院河北保定 071002 ) 摘要: 变性梯度凝胶电泳( DGGE ) 在真菌研究中技术应用的主要步骤:从样品中直接提取真菌 DNA ,选取 5′端含 GC 夹的特异性引物对 18S rDNA 或 IST 序列等的部分片段进行扩增,得到合适的目的 DNA 片段,并在变性梯度的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,使不同来源的真菌 DNA 片段有效分离,再进行各种分类分析。关键词: PCR-DGGE ;变性梯度凝胶; 真菌;引物; DNA 丛枝菌根真菌(Ar buscular mycorrhizal fungi, AMF) 在自然界分布广泛, 能够与 80% 以上的陆生植物形成共生体[1-2]。它能够提高植物抗旱性、抗病性, 促进生长, 提高产量, 改善作物矿质营养, 被誉为“生物肥料”[3] 。由于 AM 真菌至今仍然不能被纯培养, 给菌种鉴定、遗传学以及群落生态学研究等带来不少难题[4] 。随着分子生物学技术的不断发展, 各种分子技术已被应用到 AM 真菌研究中。目前, 国外已在这一领域进行了大量的探索和研究, 而国内在该领域研究则进展缓慢[5] 变性梯度凝胶电泳( Denaturing Gradient Gel Electrophoresis , DGGE ) 是在含有浓度线性递增变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 将具有不同碱基序列而长度相似的双链 DNA 分离[8]。变性梯度凝胶电泳技术是由 Fische r和 Lerma n于 197 9 年最先提出的用于检测 DNA 突变的一种电泳技术[7]。后来, 该技术逐渐被应用于微生物生态学研究, 并证实了这种技术在研究自然界微生物群落结构变化、遗传多样性和种群差异方面具有明显的优越性, 并且该方法能够较准确地反映出环境样品中优势种群的动态变化规律[8-9]。目前, 在原核生物生态学研究中 DGGE 技术已发展的较为成熟。然而, 将其应用于真核生物生态学研究的报道, 并不多见[5]。 1 样品 DNA 的提取从样品中提取 DNA 的产率, 直接决定了 DGGE 条带的代表性[14] 。 DNA 产率低, 其条带的代表性就差。真菌分布广泛, 种类繁多, 为获得较高的 DNA 提取产率, DNA 提取方法也需要根据样品的特性具体分析,寻找针对性较强的处理方法。 土壤样品中真菌 DNA 的提取对于土壤样品 DNA 的提取, 通常会采用改良后的 Bead-Beating 法[5]。具体方法是: 称取 10g 土样, 放入盛有数粒无菌玻璃珠(直径 3~5 mm )的三角瓶中,加 15 mL 提取缓冲液;在 180 r/min , 37℃条件下振荡 30 min 后,加 2 mL 20% SDS 继续振荡 10 min ; 65℃水浴 1h 后, 6 000 ×g 离心 15 min ;收集上清液,加 倍体积 PEG (30%) -NaCl( mol/L) , 混匀后室温下静止 2h,在 10 000 ×g 离心 20 min , 沉淀用 2 mL TE 重新悬浮