DNA提取方法总结.doc

.页眉. 页脚.. 对一些 DNA 提取方法的总结细菌 DNA 的提取: (一) 试剂: 2% CTAB (W/V) 2% PVP K25 (w/v) (去色素) 100mM Tris-HCl () 25mM EDTA () NaCl LiCl 3. 2M LiCl -water (抑制 RNA 酶活性) 5. 3M NaAc () 6. 96% 乙醇 7. 70% 乙醇步骤: 65 ℃预热; ( 700ul )中混匀, 65 ℃, 10min ; ( 25 : 24 : 1),振荡,离心 12,000rpm , 10min ; ,加氯仿/异戊醇( 24 : 1)振荡,离心 12,000rpm , 10min ; ,重复 4步骤; 1/10 体积的 3M 醋酸钠和 倍体积的乙醇(或加入等体积的异丙醇),- 20C 沉淀; 11. 离心 12,000rpm , 10min ; 12. 弃上清, 70 %乙醇洗,也可以再用 100 %乙醇洗,然后溶解于 100ml 水中。(二)(我们常用的方法,但是有时有些细菌特别不好提,就用上面的方法) LB 培养基, 37 ℃震荡培养过夜。 培养物 12000rpm 离心 2min 。 3. 沉淀物加入 567 ul的 TE 缓冲液,反复吹打使之重新悬浮,加入 30ul 10%SDS 和 15ul 的蛋白酶 K,混匀,于 37 ℃温育 1h. 100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀,再加入 80ul CTAB/NaCl 溶液,混匀后再 65 ℃温育 10min 。 5. 加入等体积的酚/ 氯仿/ 异戊醇混匀,离心 4-5min, 将上清转入一只新管中,加入 - 倍体积的异丙醇,轻轻混合直到 DNA 沉淀下来,沉淀可稍加离心。 1ml 的 70% 乙醇洗涤后,离心弃乙醇. 真菌 DNA 的提取: (一) , 在液氮中迅速研磨成粉 4mL 提取液,快速振荡混匀 4mL 的氯仿:异戊醇(24:1) ,涡旋 3~ 5min (此处是粗提没有加酚,可以节约成本的哟!) , 4℃, 5min :异戊醇(24:1) 再抽提一次( 10,000 rpm , 4℃离心 5 min ) ,加入 2/3 倍体积的-20 ℃预冷异丙醇或 倍体积的无水乙醇沉淀,混匀,静置约 30 min ulT E中? ,用 75% 乙醇反复漂洗数次,再用无水乙醇漂洗 1次,吹干,重悬于 500 1 ul RNaseA ( 10 mg/mL ), 37 ℃处理 1 hr .页眉. 页脚.. ( ) :氯仿:异戊醇(25:24:1) 和氯仿:异戊醇(24:1) 各抽提 1次( 10,000 rpm , 4℃离心 5 min ) 10. 取上清, 1/10V 3M NaAc, 体积的无水乙醇, -70 ℃沉淀 30 min 以上