蛋白质一级结构测定.ppt

第三章蛋白质的一级结构的测定
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蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。
，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。
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蛋白质的一级结构的测定是一项非常复杂的工作
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A. 样品必需纯（>97%以上）；
B. 知道蛋白质的分子量；
C. 知道蛋白质由几个亚基组成；
D. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。
E. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。
（1）测定蛋白质的一级结构的要求
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（2）蛋白质分子的一级结构测定方法
氨基酸组成分析
氨基酸末端分析
蛋白质中肽链的拆离
肽链的部分降解及肽片断的分离
肽段氨基酸顺序测定及肽段重叠
二硫键与酰胺基的定位
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①测定蛋白质氨基酸残基组成
根据蛋白质分子量，计算出构成蛋白质的各种氨基酸的数量；
采用经典的阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法，对蛋白质水解液及各种游离氨基酸的组分含量进行分析。
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②测定蛋白质分子中多肽链的数目
通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。
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由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分单独分离出来；
几条多肽链通过二硫键交联在一 起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基；
用过氧酸氧化或巯基化合物还原二硫键断裂，用烷基化试剂保护生成的巯基，防止其重新被氧化；
如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基)。
③二硫健的断裂及多肽链的拆分
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★巯基的保护
用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化
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用酶溴化氢选择性降解多肽链产生的肽段用酸水解、碱水解（针对色氨酸分析）或酶水解后，用氨基酸自动分析仪测定；
测定并计算出蛋白质的氨基酸种类和数量；用Edman反应分析各肽段氨基酸顺序；
④多肽链的选择性降解及肽段的氨基酸组成和顺序的测定
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