氯化两面针碱体外肾毒性探讨.doc

氯化两面针碱体外肾毒性探讨.doc氯化两面针碱体外肾毒性探讨
【摘要】
目的观察氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293的毒性作 用。方法采用mTT法检测不同浓度氯化两面针碱对人胚肾细 胞293的毒性。结果氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293 有一定的毒性作用。结论氯化两面针碱可抑制人胚肾细胞 293的增殖，对肾脏有一定的毒性。
【关键词】
氯化两面针碱;人胚肾细胞293;体外肾毒性
中药抗肿瘤是目前医学界研究的一个热点，很多中药 成分被证实具有较好的抗肿瘤效果而得以逐步走向临床。氯 化两面针碱是两面针制剂的主要有效成分，在抗炎、镇痛、 抗肿瘤、心血管系统等方面的作用已有较多报道。氯化两面 针碱有较强的抗癌作用，据文献报道，氯化两面针碱对LEwIS 肺癌、鼻咽癌、肝癌、慢性粒细胞白血病均有抑制作用，对 小鼠艾氏水癌、肝癌腹水也有效，而其对肾的毒性问题未见 报道,特别是在细胞水平、分子水平都未见报道。作为一个 新型的抗肿瘤药物，其肾毒性大小至关重要。本实验中，我 们考察了氯化两面针碱在体外对人胚肾细胞293的毒性作 用。
1材料与仪器
试药氯化两面针碱标准品；四口塞哩蓝；二甲基亚 m ； DmEm;胎生牛血清;胰蛋白酶;谷氨酰胺;PBS;注射用青霉
素钠;注射用硫酸链霉素；HEPESo
仪器二氧化碳培养箱；倒置显微镜；酶标仪；超低温冰 箱;96孔培养板;6孔培养板;超净工作台；台式离心机；电热 恒温水浴锅。
细胞株人胚肾细胞293细胞株。
2方法
培养液的配置DmEm培养干粉以1000ml三蒸水充分溶 解，加入，，加入青霉素、链霉素使其终浓度为100U・ml-1, 在超净工作台中过虑除菌，分装成90ml/瓶,-20°C保存备用， 临用前加10ml热灭活胎牛血清。
梯度氯化两面针碱的制备精密称定氯化两面针碱标准 品适量用DmSo溶解后，用无血清培养液依次稀释，配置 成，，，，ug/ml浓度梯度的氯化两面针碱系列浓度样品，置 于4°C冰箱中保存备用。
细胞培养人正常胚肾细胞293分别培养于含DmEm完全 培养液的玻璃培养瓶中，置于37°C,饱和湿度，5%co2的培 养箱中，定期观察更换培养液。细胞铺满培养瓶底部时传代, 用PBS冲洗两次，加入%胰蛋白酶2ml消化液，置37°C约Imin, 倒置显微镜下观察消化细胞，若胞质回缩，细胞间连接消失, 表明此时细胞消化适度，吸取上清液，加入完全培养液2ml, 反复吹打，将细胞吹打均匀，调整培养瓶中细胞浓度至IX
105/ml,加入完全培养液，置于co2的培养箱。实验中所用
细胞均处于对数生长期，活细胞数大于95%。
氯化两面针碱的肾毒性实验取对数生长期的人正常胚 肾细胞293用胰酶消化后，用DmEm培养液吹打制成细胞悬 液加入96孔培养板，每孔190ul,在5%co2、37°C培养箱 培养24h待细胞完全贴壁后，受试孔加入系列浓度受试药物 10ul每药3孑L,阴性对照孔加入含%DmSo的无血清培养基 lOuL空白对照孔加入等量的含药无血清培养基而无细胞, 各孔加培养基至200 1x 1,培养箱孵育24,48,72h,加入5mg/ml 的mTTlOul,继续在培养箱培养4h,取出96孔板顷去上清 液，加入DmS。每孔150U1,在摇床上振动摇匀lOmin,在 酶标仪570nm和630nm的波长下测得各孔oD值