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胶体金免疫标记技术技术资料 1 一、胶体金的制备根据不同的制备方法,可以制备出直径 1 -500nm 的胶体金粒子,但做为免疫标记探针,其直径应在 3-30nm 范围内。在氯化金( HAuCl 4)水溶液中加入还原剂使之还原并聚积形成胶体金粒子。使用不同种类、不同剂量的还原剂,可以控制所产生的粒子大小。即粒子大小取决于反应溶液中最初还原试剂和还原核的数量。还原剂浓度越高,核浓度也越高,氯化金的还原也就从更多的还原中心开始,因此产生的胶体金粒子数量越多,但体积也越小。粒子直径每增加一倍, 数量减少为原来的 1/8 。以柠檬酸钠和单宁酸做还原剂,能够制备大小相对一致、直径 3 ~16nm 的胶体金。因此一般胶体金探针均使用该方法进行。但该方法制备的胶体金粒子直径范围较窄,而且残留的多聚单宁酸残基往往干扰某些蛋白与金粒子的结合。此时在溶液中添加 ~ %的 H 2 O 2能够去除这些残基。双标记或制备 5-10 nm 的胶体金时建议使用该方法。利用柠檬酸为还原剂,可以制备 12 ~150 nm 直径的胶体金。但制备大体积的胶体金时,胶体金粒子的误差也同时增加。因此做单标记时,建议使用该方法制备 12-16 nm 直径的胶体金。除了上述方法外,也可以用磷作为还原剂来制备 5 nm 的胶体金,它避免了单宁酸残基的问题,但所形成的金粒子体积变化较大。磷易燃且有毒,制备的残液需进一步处理, 故该方法已经很少使用。氯化金极易吸湿,故一般均以小剂量密封保存( 或 1g ) ,因此在配制氯化金溶液时一次配完,暂时不用的可以用 ml 试管分装为 1 ml 保存( -20 ℃) 。注意各种玻璃器皿一定要洗净并用双蒸水多次冲洗,有条件时可硅化处理( 1 %双氯硅烷/ 氯仿浸泡 1 小时, 烘干) 。配制各种试剂时均使用双蒸水,随后再用 μ m微孔滤膜过滤后使用。三角瓶可反复多次使用,不用时应密封保存,以防污染。制备好的胶体金保存寿命较长,可 4 ℃保存 6个月以上或室温下保存 1-2 个月。当出现明显悬浮物或沉淀后表示已不可再用。但无论无何,在保存较长时间后应进行镜检,如出现大量胶体金粒子凝集,说明已经过期。 2 1 、单宁酸/ 柠檬酸钠法制备 3 ~ 16 nm 胶体金(1) 取一 250 ml 三角瓶,加入 79 ml 双蒸水和 1 ml 1 %氯化金,预热至 60 ~ 70 ℃。(2) 取一 50 ml 烧杯,加入 4 ml 1 %柠檬酸钠,然后根据所制备金粒子体积大小加入不同用量的单宁酸及等量的 25 mM K 2 CO 3。预热至 60 ~ 70 ℃。 K 2 CO 3 的作用是保持溶液的中性 pH 。因此如果单宁酸的量少于 ml 时,对 pH 的影响不大, K 2 CO 3 可以省略。(3) 将上两种溶液迅速混合并充分混匀,加热至沸并保温 10 分钟。自然冷却。柠檬酸钠( ml ) 单宁酸( μ l ) 胶体金( nm ) 4 5000 3 4 2000 4 4 500 6 4 120 8 4 70 10 4 10 16 2 、白磷还原法制备 5 nm 胶体金(1) 取 250 ml 三角瓶一个,加 79 ml 双蒸水, 1 ml 1% 氯化金,并用 M K 2 CO 3 将溶液调至中性( ) 。(2) 取 ml 饱和磷/ 乙醚溶液加到 ml 试管中,再加 ml 乙醚,混匀。取 ml 加入溶液( 1 )中( 磷有毒且易燃,操作请带手套,多余的磷溶液用 CuSO 4 进行中和) 。(3) 室温下轻轻摇匀 15 min ,然后加热沸腾并保持 5 min ,自然冷却。 3 3 、柠檬酸三钠法制备 12-30 nm 胶体金(Frens, 1973) (1) 取 250 ml 三角瓶一个,加 100 ml 双蒸水及 1 ml 1% 氯化金,加热沸腾; (2) 取不同量的 1% 柠檬酸钠加入上述溶液中。混匀,再保持沸腾 30 min ,溶液颜色首先变黑,再逐渐变红,粒子体积较小时,溶液呈桔红色,而粒子体积较大时,则颜色偏向紫色。注意: (1) 由于使用试剂质量及其它方面可能存在的误差,以及制备过程中的其它问题,胶体金粒子的大小及一致性与理论值可能有偏差,因此,在制备完成后必须进行镜检。如出现粒子体积偏差太大,粒子凝聚,粒子边缘不清晰等问题,须重新制备。(2) 胶体金溶液最好保存在 4 ℃冰箱中;也可保存在室温下,一般可保存 1-2 个月。但决不可保存在 0 ℃以下,否则金粒子发生凝聚。柠檬酸钠(ml) 胶体金(nm) 5 12 4 16 3 24 30 4 二、蛋白-金复合体的制备 一般认为胶体金粒子表面为一层 A