southern DIG试剂盒说明书(CSPD)翻译版.doc

来自于丁香园论坛!由丁香客 freshman0316 上传! 只用于生命科学研究,不能用于诊断程序仅用于体外实验 DIG High Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit Ⅱ采用地高辛-dUTP 进行随机引物 DNA 标记,碱性标记,利用 CSPD 化学发光检测,随时即用。货号: 11 585 614 910 此试剂盒储存条件: -15 ℃到-25 ℃。此试剂盒可对 10ng-3 μ gDNA 进行 12 次标记反应, 可检测 10× 10cm 2 面积的杂交膜 24 张。指导手册 版 1前言 内容表 1 前言 内容表 试剂盒成分 2. 介绍 产品简介 3. 操作步骤和所需材料 在你开始前 流程图 地高辛标记 DNA 标记效率的确定 DNA 的转移和固定 杂交 免疫检测 DNA 印记的洗脱和再杂交 4. 附录 故障排除 参考文献 订购信息 试剂盒的成分瓶号标记内容包括功能 1 DIG- 高效引物 50μL 地高辛标记的高效引物 5× 浓度的标记混合物:优化的浓度的随机引物,核苷酸, 地高辛标记的 dUTP ( 碱标记的), Klenow 酶和缓冲液成分随时可用澄清的粘液用于 DNA 的高效随机引物标记 2 DIG 标记的对照 DNA 20μL5μ g/mL 质粒 pBR328 DNA (用 Bam HI 线性化) 澄清溶液用于确定标记效率 3 DNA 稀释缓冲液 3管 1mL 50μ g/mL 鱼精 DNA,10mM Tris-HCl,1mM EDTA, 在 25℃澄清溶液 4 抗地高辛的碱性磷酸酶结合物 50μL 750U/mL 从羊中获取的, Fab 段,结合碱性磷酸酶澄清溶液 5 CSPD 随时可用 50mL CSPD 澄清溶液 6 封闭液 4× 100mL 10× 浓度黄色,粘液 7 地高辛杂交颗粒 100mL 地高辛杂交液共 4 瓶,用于 DNA 杂交附加仪器与所需试剂除了上表中列出的试剂外, 你必须准备一些溶液。在下表中, 你可以找到不同操作程序需要准备的设备概要。在每个操作程序的前面提供了详细的信息。操作程序仪器设备试剂 DIG-DNA 标记水浴灭菌的双蒸水 灭菌的 EDTA 标记效率的半定量带正电荷的尼龙膜* 地高辛洗涤和封阻缓冲组合* 或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液 DNA 转移和固定紫外光盒或者商业化可用于紫外交联的其他设备 20× SSC 或者 10× SSC 杂交尼龙膜,带正电荷* 杂交袋*, 或者耐热的塑料袋或者滚筒瓶注意: 当用地高辛杂交缓冲液工作时,不要用开口的托盘。 免疫检测耐热的塑料袋或者滚筒瓶杂交袋* 地高辛洗涤和封阻缓冲液组合* ,或者洗涤缓冲液马来酸缓冲液检测缓冲液 DNA 斑点的脱色和重新标记探针大的托盘水浴 10× SSC 10%SDS NaOH * 标记的产品可以从 Roche Applied Science 获得。 产品概况实验原则此试剂盒采用 DIG( 地高辛), 一种甾类半抗原, steroid hapten 去标记 DNA 探针用于杂交和后续的免疫检测[1,2,3] 。步骤描述 DNA 标记根据随机引物标记技术采用地高辛标记引物获得了地高辛标记的 DNA 探针。地高辛标记的高效引物是一种专门生产的反应混合物, 其中含有地高辛 dUTP, 碱性标记(图 1 )和所有的试剂,包括随机引物标记所必须的酶,已预先混合优化的 5× 浓度反应缓冲液。杂交根据标准方法,地高辛标记的探针可以与固定在膜上的核酸杂交。采用碱标记形式的地高辛-11-dUTP 能够更加容易和有效的被洗脱下来,使固定在膜上的核酸可以与其他的地高辛标记探针再次杂交。免疫检测杂交探针可以用抗地高辛的碱性磷酸酶进行免疫检测, Fab 段,然后采用即时可用的化学发光底物 CSPD 可以看到杂交结果。采用碱性磷酸酶可以对 CSPD 进行, 酶的脱磷酸化, 导致在最大波长 477n m 处有光的发射(图2), 这一现象可以用适合的图像仪或者 X 光片进行记录。胶片的曝光时间范围只在 5-30 分钟内。图1 DIG-dUTP ,碱性标记图2 CSPD 反应应用地高辛标记 DNA 探针可以用于: 所有类型的滤膜杂交总基因组 DNA 中单拷贝基因的检测, 甚至对于高度复杂的生物体也可以进行检测,如人,大麦和小麦。样品材料至少 100bp 的 DNA 片段线性的质粒, cos 质粒或者 DNA 超螺旋的 DNA 实验时间此表格列出