我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析.ppt

我国人用狂犬病疫苗株病毒糖蛋白生物信息学分析试讲:张昕亮【摘要】?目的测定我国人用狂犬病疫苗株 4aGV 、 CTN-1V 和 PV2061 株病毒糖蛋白 G 基因序列,并对其进行生物信息学分析。?方法 RT-PCR 扩增 3 株病毒糖蛋白 G 基因, 分别克隆至 pGEM-T 载体中,转化大肠杆菌 DH5 α,筛选阳性克隆,进行测序。应用 DNAstar MegAlign 软件分析 3 株病毒糖蛋白的同源性, AntheProt 5. 0 及 DNAstar Protean 软件分析 3 株病毒糖蛋白的结构及潜在 B 细胞抗原表位的差异。?狂犬病是由狂犬病病毒( Rabies virus , RV ) 引起的人兽共患疾病,一旦发病,几乎 100 %死亡,疫苗接种是预防该病的重要措施。目前,我国人用狂犬病疫苗生产用毒株主要有 aG 、 CTN-1V 和 PV2061 株,其中 aG 株和 CTN-1V 株为我国自行分离并传代适应, PV2061 株来源于法国巴斯德株。上述病毒株生产的人用狂犬病疫苗经临床应用显示, 具有良好的保护效果。我国人用狂犬病疫苗生产用原始种子 4aGV 、 CTN-1V 、 PV2061 株病毒糖蛋白( Glycoprotein ,G)全基因序列进行测定,分析 3 株病毒糖蛋白氨基酸序列的同源性 1. 材料与方法 1. 1 菌毒株狂犬病病毒原始种子批 4aGV 、 CTN-1V 和 PV2061 均由中国食品药品检定研究院病毒一室保存;感受态大肠杆菌 DH5 α。 1. 2 主要试剂 QIAamp Viral RNA Mini Kit Reverse Transcription System TaKaRa LA Taq 誖 DRR002A EZNA 誖 Gel Extraction Kit pGEM-T vector system ? 1. 3 引物设计及合成根据 GenBank 中登录的 aG 、 CTN 、 PV 株病毒 M、 L 区基因序列, 应用 Primer Premier5. 0 软件设计位于 M 区及 L 区的上下游引物, 见表 1。 1. 4 病毒 G 区基因的扩增用 QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取病毒 RNA , Reverse Transcription System 提供的随机引物逆转录合成 cDNA 第一链,再以其为模板, PCR 扩增目的基因。反应体系为: c DNA 2 μl, 10 × buffer 5 μl, 2. 5 mmol / L dNTP 4 μl,上下游引物各 2 μl ( 10 pmol / L), LA Taq 1 μl,去离子水补足体积至 50 μl。反应条件为: 95 ℃预变性 5 min ; 95 ℃ 30 s , 53 ℃ 30 s , 72 ℃ 2 min ,共 30 个循环; 72 ℃再延伸 10 min 。扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳鉴定, EZNA 誖 Gel Extraction Kit 纯化回收。? 1. 5 克隆测序将 PCR 纯化产物与 pGEM-T vector 连接,转化感受态大肠杆菌 DH5 α,蓝白斑筛选阳性克隆, 经菌落 PCR 鉴定后,送北京三博远志生物技术有限公司测序,每个片段至少送 6 个阳性克隆。? 1. 6 病毒糖蛋白生物信息学分析应用 DNAstar 中的 MegAlign 软件分析 3 株病毒糖蛋白基因序列及氨基酸序列的同源性;应用 AntheProt 5. 0 及 DNAstar 中的 Protean 软件分析 3株病毒糖蛋白的结构及潜在 B 细胞抗原表位的差异。 2. 结果? 2. 1 病毒 G 区基因扩增产物的鉴定?应用配对引物分别扩增 4aGV 、 CTN-1V 和 PV2061 ?株病毒 G 区基因,扩增产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分?析,均可见约 2 300 bp 的特异条带,大小与预期相符; ?应用 3 对引物分别扩增 4aGV 、 CTN-1V 和 PV2061 ?株病毒 G 区基因,仅配对引物扩增出相应条带。尽?管应用 aG-MGL-F / R 引物对 PV2061 株病毒 G 区?基因进行扩增时有条带出现,但该条带大小及扩增?产物浓度均与目的片段明显不符,为非特异性扩增。?因此 3 对引物均具有特异性,与其他毒株无特异性?配对。见图 1。