DNA重组技术在实验动物科学中的应用.pdf

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重组技术在实验动物科学中的应用
魏汛
第三军医大学实验动物学教研室, 重庆
重组技术是基因工程的核心, 指在体外条件下, 将不同生物的基因进行人工“剪
切”“组合”和“拼接”, 使遗传物质重新构建, 然后通过载体如细菌质粒、噬菌体和病毒
等转入受体细胞内进行无性繁殖, 并使所需要的基因在受体细胞内表达, 产生人类所需要的
基因或产物, 或创建新的生物类型。重组技术涉及核酸分子杂交技术、反应、限
制性核酸内切酶等工具酶的应用、基因转移等多项技术方法, 本文就它们在实验动物科学中
的应用作一综述。
核曦分子杂交技术
两条互补单链复性变为双链的现象称为核酸分子杂交。核酸分子杂交不仅可
以在两条互补链之间进行, 也可在互补和链之间进行。如果把单链或
用合适的标记物如放射性同位素, 生物素、地高辛予以标记, 当作探针, 进行杂交
反应, 并用合适的方法如自显影术、显示反应把标记物检测出来, 也就把发王分子杂交
这一事实给予了肯定。伺时由于标记探针是预先知道的基因片段或特定序列, 就可推定与之
‘
杂交的核酸链是与探针为同源片段或序列, 此即为核酸分子杂交技术。根据杂交反应环境, 核
酸分子杂交可分固相杂交和液相杂交, 固相杂交是将先固定在膜上硝酸纤维素膜或
尼龙膜, 然后加入标记探针在溶液中进行杂交, 漂洗除去未杂交的探针, 再进行检
测。液相杂交是标本中的与探针在溶液中进行杂交。常用的固相杂交方法及其特
点见附表。
附裹核酸分子杂交方法
杂交类型特点说明
几印迹杂交酶切后转移到膜上酶切图谱特定序列分析
五几印迹杂交转移到膜上特定序列分析
斑点杂交或标木点在或抽滤在膜上疾病诊断
菌落杂交菌落或菌苔点种在膜上疾病诊断、病原菌鉴定, 菌落
原位杂交和噬菌斑原位杂交用
于克隆株的筛选
夹心杂交未标记探针先吸附于膜上, 用于污染标本疾病诊断
,
与标本杂交后再加标记探针特异性更强
与标本杂交
原位杂交细胞和组织病理切片主要对病毒病诊断、细胞内
病毒定位
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反应
聚合酶链反应, , 又称无细胞克隆技术, 是一
种对特定的片断在体外进行快速扩增的方法, 在数小时内可使几个拷贝的模板序列甚至
一个分子扩增“倍, 大大地提高了的得率。反应体系只需要一个检测
的靶作为复制模板, 一对与靶两端互补结合的寡核昔酸作为引物, 一种聚合
酶及其所需的底物即四种脱氧单核昔酸以及最适反应条件等。所采用的样品
很广泛, 用量甚少而且无苛求, 只要含微量靶的体液、组织细胞、分泌排泄物、石蜡切
片等均可作为检测对象。引物需按靶两端已知序列, 预先设计合成, 一般长度为、
个硷基, 其中十含量占肠左右为宜, 引物内部或一对引物之间应无互补序列, 并尽力避
免引物与非靶序列之间有同源性。的三个基本步骤高温℃使靶变性
成单链模板低温一般为℃退火, 让引物与模板特异结合在适温一般为℃下,
聚合酶随引物‘一‘方向延伸新链, 经反复上述变性、退火和延伸等循环