SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质.ppt

实验八 SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
一、目的要求
SDS－聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质技术
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
二、原理
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(N，N，N，N—tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
(1)在一定浓度时，凝胶透明，有弹性，机械性能好；
(2)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，在很多溶剂中不溶；
(3)对pH和温度变化较稳定；
(4)几乎无吸附和电渗作用，只要Acr纯度高，操作条件一致，则样品分离重复性好；
(5)样品不易扩散，且用量少，其灵敏度可达10-6g
(6)凝胶孔径可调节，根据被分离物的分子量选择合适的浓度，通过改变单体及交联剂的浓度调节凝胶的孔径；
(7)分辨率高，尤其在不连续凝胶电泳中，集浓缩、分子筛和电荷效应为一体。因而较醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳等有更高的分辨率。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
凝胶浓度(T)的选择与被分离物质分子量密切相关。
分子量范围与凝胶浓度的关系
分子量范围 适用的凝胶浓度/(%)
蛋 白 质
104 20-30
1-4×104 15-20
1-5×104-1×105 10-15
1×105 5-10
5×105 2-5
核酸(RNA)
104 15–20
104–105 5-10
105-2×106 2-
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
聚丙烯酰胺凝胶电泳分为连续系统与不连续系统两大类。
目前常用的多为圆盘电泳(如图1)和板状电泳(如图2)，两者电泳原理完全相同。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
图1 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面)
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
图2 夹心垂直板电泳槽示意图
返回
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶，-HC1。分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶， Tris-HC1。 Tris-甘氨酸缓冲液。2种孔径的凝胶、2种缓冲体系、3种pH值使不连续体系形成了凝胶孔径、pH值、缓冲液离子成分的不连续性，这是样品浓缩的主要因素。
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质
（1）样品浓缩效应
(a)凝胶孔径不连续性：
(b)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性；
前导离子或快离子：HC1解离出的氯根(C1-)
尾随离子(trailing ion)或慢离子：甘氨酸根
mclcl>mpp>mGG(Cl代表氯根，P代表蛋白质，G代表甘氨酸根)有效迁移率=m，m为迁移率，为解离度)
，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质；
（c)电位梯度的不连续性：
(2)分子筛效应
(3)电荷效应
SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分离蛋白质