实验、大肠菌群的检验
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实验目的
掌握鉴别大肠菌群的方法。
掌握以最大概率数法测定大肠菌群数量的方法。
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实验原理
大肠菌群指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽孢杆菌。该菌主要来源于人畜粪便,以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品有否被肠道致病菌污染。
食品中大肠菌群以100ml 检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。
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实验设备
恒温培养箱:(36±1)℃
显微镜
培养皿
试管、移液管、三角烧瓶、小倒管
天平
载玻片
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实验试剂
乳糖胆盐发酵管:
20g蛋白胨、5g 猪胆盐及10g乳糖溶于1L水中,校正pH为7 .4,加25ml溴甲酚紫指示液( g/L),分装每管20 ml, 并放入一个小倒管,115℃高压灭菌20 min。
伊红美蓝琼脂平板:
10g蛋白陈、2gK2HPO4及17g琼脂溶解于1L水中,,分装于锥形瓶内,121℃高压灭菌15min。临用时加人10g乳糖并加热溶化琼脂,冷至50~55℃。加人20mL伊红溶液(20g/L)和10ML美蓝溶液()摇匀,倾注平板。
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乳糖发酵管:
将20 g蛋白陈和10g乳糖溶于1L水中,,加入25mL溴甲酚紫指示液(),按检验要求分装,并放人一个小倒管,加热至115℃高压灭菌15 min
灭菌生理盐水:%
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革兰氏染色液:
①结晶紫染色液:
1g结晶紫溶于20mL95%乙醇,与80mL草酸铵溶液(10g/ L)混合,摇匀。
②革兰氏碘液:
1g碘与2g碘化钾混合后,用少量水溶解,稀释至300 mL。
③沙黄复染液:
%乙醇中,然后用90ml水稀释,混匀。
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实验内容与步骤
1)检样稀释(无菌操作)
①将25mL(或g)检样置于含225mL灭菌生理盐水的灭菌玻璃瓶,充分振摇(固体检样用匀浆器,用8000-10000r/min的速度处理1 min)制成1:10的均匀稀释液。
②用1mL灭菌吸管吸取1:10稀释液1mL,注入含有9mL灭菌生理盐水的试管内,混匀,制成1 :100的稀释液。
③另取1mL灭菌试管,按②操作依次做10倍递增稀释液,每稀释一次,换用一支1 mL灭菌试管。
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2)乳糖发酵实验
接种2mL待检样品于乳糖胆盐发酵管内。接种3个稀释度,每一稀释度接种3管,置(36土1)℃温箱内培养(24士2) h。如所有乳糖胆盐发酵管都不产气,则可报告为大肠杆菌群阴性,如有产气者,则按下列程序进行。
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3)分离培养
将产气的发酵管分别转接在伊红美蓝琼脂平板上,置(36士1)℃恒温箱内培养18一24 h。取出,观察菌落形态,并做革兰氏染色和证实试验。
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