Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621说明书(第一链cDNA合成试剂盒).docx

Thermo-Scientific-RevertAid-First-Strand-cDNA-Synthesis-Kit-K1621说明书(第一链cDNA合成试剂盒)
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注意事项
避免核酸酶污染
RNA的纯度和完整性对于合成全长cDNA至关重要。RNA很容易被RNA酶A降解，而RNA酶A广泛 稳定地存在于实验室中。试剂盒中的所有成分都经过了无RNA酶的严格验证并保证不含有RNA酶。为 防止污染，实验室和所有实验准备工作都必须保证没有RNA酶污染。
避免RNA酶污染的常规建议：
● 用DEPC处理实验用到的所有管子和枪头，或者购买已经证明无核酸酶的实验用具。
● 整个实验过程戴手套，因为皮肤是RNA酶的一个常见来源。并经常更换手套。
● 使用无RNA酶的试剂，即使是超纯水也要确保无RNA酶（比如#R0581，无RNA酶的高纯度水）
● 使用RNA酶抑制剂，比如试剂盒中提供的Fermentas RiboLock™RNA酶抑制剂来保护RNA。
● 试剂盒如不使用，要严格密封保存。在反转录过程中，所有管子要确保扣严。
模板RNA
通过标准方法得到的细胞总RNA可用本试剂盒获得第一链cDNA。纯化过的RNA要保证不含有盐， 金属离子，乙醇和苯酚，因为以上成分会干扰第一链cDNA的合成反应。可采用乙醇沉淀RNA的方法去 除掉痕量污染物（然后再用75%冷乙醇冲洗沉淀两次）。如果要进行RT-PCR，模板RNA要确保没有DNA 污染。在进行cDNA合成前，模板RNA必须用无RNA酶的DNA酶I（#EN0521）处理去除掉痕量DNA。 实验过程要设置无RT对照反应，即此对照反应中含有除逆转录酶以外的其他所有RT-PCR成分（RT-对 照）。
去除RNA中基因组DNA的实验步骤:
1. 将以下成分加入到一个无RNA酶的管子中：
RNA
1μg
10×反应缓冲液（含有MgCl2）
1μl
DNA酶I，无RNA酶（#EN0521）*
1μl（1u）
无核酸酶的高纯度水
加到10μl
* 对于每1μg RNA，不要使用超过1u的DNA酶I（不含RNA酶的）。
2. 37°C 孵育 30 分钟。
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3. 加入1 μl 50 mM EDTA，65°C 孵育10分钟。在含有二价阳离子(1)而缺乏螯合剂的环境中，RNA
会水解。或者可采用酚/氯仿试剂抽提的方法来替代加EDTA孵育这一步骤。
4. 使用制备好的RNA为模板进行逆转录反应。
RNA样品品质 在进行cDNA合成前，要先评估RNA的完整性。最经常使用的方法是跑变性的琼脂糖凝胶，然后用
溴化乙锭（简称EB，以下同）染色。如果来源于真核细胞的总RNA在跑完胶后可清晰看到18s和28s rRNA
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的条带，可认为RNA是完整的。28s rRNA的条带亮度约为18s rRNA的两倍。任何拖尾条带都是mRNA
降解的信号。如果这种拖尾条带出现，需要重新提取总RNA样品。
为了进行RT-PCR，需要评价纯化的RNA（人类，小鼠或大鼠）的适用性。常用方法是在RT-PCR 中设置对照，此对照含有试剂盒中提供的模板RNA和对照用GAPDH引物。GAPDH特异性引物与人， 小鼠，大鼠的GAPDH基因完全互补，RT-PCR扩增后得到496bp的产物。
RNA 样品用量
● ng - 5 μg的总RNA或者1 ng - 500 ng的poly(A) mRNA作为模板合成第一链cDNA，此反应可作 为两步法RT-PCR中的起始步骤。
● 使用1 μg分离纯化的mRNA作为模板合成的第一链cDNA，可用于第二链合成或者后续克隆反应。
引物 合成第一链cDNA使用的引物可为oligo(dT)18引物，随机六聚体引物或者基因特异性引物中的任意
一种。 Oligo(dT)18引物针对具有3’poly(A)尾巴的真核mRNA。随机六聚体引物适用于总RNA（rRNA或
者mRNA）。因此，相对Oligo(dT)18，使用随机六聚体引物会得到更复杂的第一链cDNA混合物，这样 会降低后续PCR实验的特异性和精确性。但是随机引物在以下几种情况中是有优势的：比如没有poly(A) 尾巴的mRNA或者使用富含poly(A)结构的RNA为模板。基因特异性引物用于从总RNA或者mRNA混合 物中合成特异性的某条或者几条cDNA，这种特异引物需要使用者自己提供。
第一链cDNA合成过程 第一链cDNA合成可进行单样本反应，可以使用