实验二硷性磷酸酶的动力学鉴定.doc

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实验二硷性磷酸酶的动力学鉴定
Km测定
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、原理
当温度、PH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度 [S]增
大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。此 时反应速度为最大速度（Vmax）。Michaelis Men ten对酶促反应速度与作用物浓 度之间的这种关系进行了大量实验研究，并于 1913年提出了数学方程式，即著
名的米一曼方程式：
v=
pS]
式中Km即为米氏常数，Vmax为最大反应速度，当V=V max/2时，则Km=[S]
Km是酶的特征常数，测疋Km是研究酶的一种方法。由于用Michaeis-Menten
方程中的V与[S]作图求Km，不方便，Lineweaver-Burk将上式变形，以4/V对
1/[S]作图，即:
1
Km
L+ 1
V
Vmax
廣] Vmax
1
V
心
y Vmax
Z 、1
/
Vmax
、1
1 1
Knt
作图后，将各点连线延长，直线与横轴的交点为 ，根据在横轴上的截距,
可以计算出该酶的Km。
本实验以硷性磷酸酶为例，用磷酸苯二钠为其作用物，硷性磷酸酶能分解磷 酸苯二钠产生酚和磷酸，酚在硷性溶液中与4氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧 化生成红色的醌衍生物，根据红色深浅可测出酶活力高低。其反应式如下：
利用在不同作用物浓度的条件下，测定的酶活性（ A）,按Lieweaver-Burk
氏法作图，从 x轴上的截距求得其Km值。
二、实验准备
（一）仪器
1. 恒温水浴
2•滴定管
3•有塞锥瓶

（二）试剂
1. ：
称取 （C6H5PO4Na2 • 2出0）,
用煮沸后冷却的蒸溜水溶解，并稀释至 1,000ml，力卩4ml氯仿防腐，贮于棕色瓶
内，置冰箱内保存，可用一周。
2. （）: ,溶解于蒸馏水中，并稀释至1,000ml.
3. 硷性磷酸酶液： 取纯化的硷性磷酸酶5mg，用pH10缓冲液配制成
100ml，放置冰箱内保存。或用自己提取的硷性磷酸酶液，用 pH10缓冲液稀释
至5—7倍。
4. NaOH 溶液
5. %4氨基安替比林： 称取3g4氨基安替比林及碳酸氢钠42g，用蒸馏
水溶解，并稀释至1,000ml，贮于棕色瓶中，放冰箱内保存。
6. %铁氰化钾： 称取10g铁氰化钾及30g硼酸各溶于800ml蒸馏水中，
溶解后两液混合加水至2,000ml。置棕色瓶中，放冰箱内保存。
三、操作
1. 取大试管7支，按下表操作：
试 剂
Cml)
1
2
管
£
5 6
7
0
3
4
0. 04jiu1/L 件用物液

0. 2E
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