T淋巴细胞功能测定PPT课件.pptx

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实
验
流
程
1W
③
(ELISA) ④
OVA (1mg/ml)+CFA免疫小鼠腹腔内注射500 µl
OVA+CFA加强免疫小鼠500 µl ①
摘眼球取血
无菌取脾和胸腺②
分离血清②
2W
取脾和胸腺②
淋巴细胞转化试验②
生理盐水（500 µl )免疫小鼠腹腔内注射
生理盐水加强免疫小鼠500 µl ①
2W
After 1W
对照组
实验组
抗体效价
增殖功能
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实验内容
小鼠摘眼球取血、分离血清
淋巴细胞转化试验
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教学要求
掌握小鼠血清的分离
掌握淋巴细胞转化试验的基本原理及基本操作
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淋巴细胞转化试验 (Lymphocyte transformation test)
原理
检测方法
操作步骤
应用
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实验分组及材料
器材
酒精棉球 若干
无菌纱布块 1块/组
无菌平皿 1块/组
无菌吸头（大、中、小）4盒/room
无菌96孔培养板 1块/组
可调微量加样器 4套/room
细胞计数板 1套/组
显微镜 1台/组
EP管 若干
眼科剪、小镊子 4套/room
细胞培养箱（37℃ 5%CO2)
酶标仪
离心机 2个/room
超净台 2个/room
动物及试剂
小鼠 2只/组(NS,OVA)
培养液（IMDM) 无FCS 100ml/room
培养液（IMDM)20%FCS 30ml/room
ConA（,5,10µg/ml) ml/tube
白细胞计数液（2%冰醋酸）2瓶/room
MTT（
二甲亚砜（DMSO) 5ml/组
分组： 每组四人，两人一只小鼠，其中一人胸腺，一人脾脏
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免疫血清分离过程
摘眼球取血
RT for 2hrs
Rotation
3000rpm
for 20min
Transfer serum to
a new EP
Double diffusion
Store at 4℃
ELISA
ml EP
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实验步骤
单细胞悬液的制备：
小鼠脱臼处死，用酒精棉球擦拭皮毛消毒。
于超净台内取出脾和胸腺组织(各1/2)，分别放入预先盛有2ml IMDM培养液的平皿内。
将3-4层纱布覆盖到组织上，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎。然后用1000µlml EP管中。
细胞计数：
取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20µl，加到盛有980µl计数液的EP管中，在显微镜下计数，计数方法见后。
调细胞浓度至1×107/ml，ml，设需要的细胞悬液体积为Aml,可按公式：?/ml×A=×1×107
NOTE:在稀释前一定将原细胞悬液混匀，否则细胞长时间沉淀使细胞数不准。
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细胞计数板
查出四个大方格的总细胞数(X)
算出每个大方格的细胞数：Y=X/4
每个大方格的体积为3=10-4ml
制备的细胞悬液的细胞浓度（/ml)=Y ×104×稀释倍数(50)
4
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细胞培养：
按图所示加板。
将板做好标记，在倒置显微镜下观察细胞，然后放于37℃ 5%C02培养箱中，培养48小时。
MTT掺入：（隔一天 下午2:00）
在终止培养前2小时，在显微镜下观察细胞转化情况。
每