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重庆医科大学硕士研究生学位论文人宫颈鳞状上皮永生化细胞和癌细胞胞浆及胞膜差异蛋白质组学研究摘要目的:建立唧V一16阳性的宫颈上皮永生化细胞(H8细胞株)和宫颈癌细胞(Caski细胞株)胞浆和胞膜蛋白双向电泳图谱,将二者进行比较,筛选出差异表达蛋白点进行质谱鉴定,为宫颈癌癌变机制和抗癌药物靶点的选择提供信息和帮助。方法: 1、将H8细胞和Caski细胞置于含10%胎牛血清的1640培养液中,待细胞数约达到3×106时收集细胞,加入亚细胞结构蛋白质提取试剂分别提取胞浆和胞膜蛋白质。 2、用双向凝胶电泳(2一dimensional gelelectrophoresis,2-DE) 分别分离H8和Caski细胞的胞浆和胞膜蛋白质,经银染后用 ImageMaster 2D软件进行图像分析,寻找出显著差异蛋白点。 3、对差异表达蛋白斑点用胰酶进行酶切,基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪()分析酶切片断,得到肽质量指纹图(PⅧ),使用国际互联网上Matrix Science公司提供的PMF鉴定程序进行查询鉴定。结果: 1、通过亚结构蛋白提取方法和双向电泳技术获得了清晰的、分 2 重庆医科大学硕士研究生学位论文辨率高和重复性好的H8细胞和Caski细胞胞浆和胞膜蛋白质表达的二维凝胶电泳图谱。 2、通过ImageMaster ,对H8细胞和Caski细胞胞浆2-DE图谱进行胶间的斑点匹配,发现两株细胞胞浆蛋白质凝胶图像蛋白斑点主要集中在PI为4"-'8和分子量为10---, 180KD,H8细胞胞浆蛋白斑点总数约为1 123个,Caski细胞胞浆蛋白斑点总数约为123 1个,匹配率为70%。比较两个图谱发现有8个蛋白点的在胞浆表达中存在明显的差异。而在两株细胞胞膜蛋白质凝胶图像中蛋白斑点主要集中在PI为4--一9和分子量为10"--'200KD,H8细胞胞膜蛋白斑点总数约为1 107个,Caski细胞胞膜蛋白斑点总数约为1033 个,匹配率为71%。比较两个图谱发现有13个蛋白点的在胞膜表达中存在差异。 3、对H8细胞和Caski细胞的胞浆蛋白2-DE图谱进行比较,找到8个显著差异表达的蛋白质斑点,对其进行质谱分析,初步鉴定出6 种差异蛋白质,它们分别是:SLOOP、Ikkb(Inhibitor ofnuclear factor kappa—B kinase subunit)、CDK6(Cell division protein kinase 6)、 TAF2(Transcription initiation factor TFIID subunit 2)、 STK3 (Serine/threonine—protein kinase 3)、TRAF5(n师receptor-associated factor5)。其中STK3、TRAF5在宫颈癌细胞株胞浆中蛋白质表达缺失, SLOOP、Ikkb、CDK6、TAF2在宫颈癌细胞株胞浆中蛋白质表达上调。 4、对H8细胞和Caski细胞的胞膜蛋白2-DE图谱进行比较,筛选出13个差异表达的蛋白质斑点,对其进行质谱分析,初步鉴定出3 3 重庆医科大学硕士研究生学位论文种差异蛋白质,它们分别是:LRC8D(Leucine。rich repeat-containing protein8D)、EDAR(Tumor necrosis factorreceptor superfamily member EDAR precursor)、Metaxin-1,它们均在宫颈鳞状上皮永生化细胞株胞膜中蛋白质表达上调。结论: .在宫颈癌前病变到癌变过程中基因和其相应的蛋白质发生了很大的变化,对人宫颈鳞状上皮永生化细胞(H8)和宫颈癌细胞(Caski)2 一DE图谱进行比较,筛选鉴定出了6种差异胞浆蛋白和3种差异胞膜蛋白,其中S LOOP,IKKb,CDK6,TAF2这4种蛋白质在宫颈癌细胞胞浆中高表达,可能是通过在细胞增值、分化、抑制细胞凋亡、加快细胞周期造成细胞周期调节失控和细胞异常增殖,从而导致肿瘤的发生。而STK3,TRAF5蛋白质在宫颈癌细胞胞浆中表达缺失和LRC8D, EDAR,,从而抑制肿瘤形成。进一步研究的功能作用将对宫颈癌的病因、诊断、治疗和预防的研究等都有重要意义。关键词:H8细胞,Caski细胞,蛋白质组学,双向电泳 4 重庆医科大学硕士研究生学位论文 DIFFERENTIAL PRoTEoMICS ANALYSIS 0F CYToPLASMIC AND MEMBRANE PRoTEoMICS BETWEEN IMMOI泓LIZED CERV