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胶体金放人型葡萄球菌B型肠毒素生物传感器的研制胶体金放大型葡萄球菌B型肠毒素生物传感器的研制摘要金黄色葡萄球菌肠毒素是引起食物中毒和院内感染的最重要病原之一,葡萄球菌B型肠毒素(SEB)还是一种具有超抗原活性的外毒素,具有强大的生物学活性。快速检测SEB对预防食物中毒、保障食品安全具有重要的现实意义,但传统的SEB 检测方法由于存在检测周期长、成本高等不足,不能满足快速检测的要求,因此, 有必要建立一种高效、灵敏、快速的SEB检测方法。本论文利用抗原和抗体的特异性结合反应,研制了SEB检测的胶体金放大型电化学生物传感器,应用于食品的快速检测。获得高特异性抗体是建立高灵敏度免疫检测方法的关键。本论文首先通过基因工程方法高效表达了加入组氨酸标签的新型SEB抗原蛋白,在此基础上制备了相应的SEB抗体。具体包括:将克隆后含有组氨酸标签的SEB基因连接原核表达载体 pET 32“+)并转化大肠杆菌得到功能性高效表达,获得分子质量约为31KDa的融合蛋白, HisBind Resin方法进行纯化后,鉴定蛋白的免疫原性和特异性。 SEB蛋白纯品免疫新西兰兔,通过免疫亲和层析柱纯化获得分子量约为120KDa的 SEB抗体,经ELISA标准曲线证实该抗血清与SEA、SECl的交叉反应率为1%,%,¨∥L,,表明所获SEB抗体具有较高的特异性和亲和力。初步建立了检测SEB的新型生物传感器检测方法:制备了胶体金标记的SEB 抗体用于制作工作电极。通过胶体金的颜色判断、紫外曲线和电镜扫描结果,对粒径约为5nm和16nm的胶体金进行了实验条件优化,结果表明:5nm粒径的胶体金呈桔红色,颗粒大小均一,适合于标记SEB抗体;胶体金标记SEB抗体的最低稳定浓度1599/ml,最适稳定量为1899/ml,;经胶体金免疫渗滤试验出现红色斑点,证实标记后的SEB抗体探针具有较好的免疫活性和高特异性; 在此基础上,生物传感器采用胶体金放大技术,三电极检测系统,)63。/) 64。为电活性指示剂,将SEB抗体采用琼脂糖包埋技术固定于特制工作电极表面,采用循环伏安法考察了该工作电极在不同修饰阶段的电化学性能,并优化传感器中抗体的固定条件,同时采用环境扫描电子显微镜对抗体固定fj{『后琼脂糖的表面形态进行了表征,成功研制了SEB电化学生物传感器。该方法对浓度为1“∥L抗原溶液具华中农业大学2009届硕士学位论文有很好的响应信号,∥L,具有操作简单、响应时间短、选择性好等优点,进一步优化后可应用于食品中SEB的检测。关键词:葡萄球菌B型肠毒素;胶体金;生物传感器;电化学方法胶体金放大型葡萄球菌8型肠毒素生物传感器的研制 STUDY oF BIoSENSoR BASED oN CoLLoIDAL GoLD AMPLIFYING FoR DETECTIoN oF THE US ENTERoToXIN B Abstract US aureus Enterotoxin is one ofimportant etiological agents ofcausing food poisoning andhospital onset Enterotoxin B(SEB)is a kind ofsuperantigen activeexotoxins,possessing powerful biologic activity allthesame. The SEB fastdetecting method ispossessing practicalsignificance forpreventing food poison and safeguarding food security,but traditionalmethods plicated andtime consuming,inability ofachieving rapid detection itisvery necessary to establish asensitiveand thisthesis,using specificbinding reaction of antigens and antibodies,the main purpose is to develop acolloidalelectrochemical biological sensor method forrapid detection ofSEB infoods. The key point ofhigh se