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山东农业大学
博士学位论文
C3d分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究
姓名:张德庆
申请学位级别:博士
专业:预防兽医学
指导教师:牛钟相
2011-06-05
山东农业大学博士学位论文
中文摘要
近年来,随着分子生物学、免疫学理论和技术的发展,运用基因重组表达技术研制
预防、治疗用生物制品己经成为免疫学领域研究的热点,其中核酸(DNA)疫苗倍受青
睐。该疫苗是继灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗及基因工程疫苗后的新一代疫苗。
核酸疫苗具有同时激发机体体液和细胞免疫应答、使用安全、易于生产等优点,并可将
多种基因联合在一起制成基因联合疫苗。然而由于 DNA 疫苗蛋白表达量低,激发的免
疫应答较弱,从而限制了其开发应用速度。因此,提高 DNA 疫苗的免疫效果已成为基
因免疫研究中急需解决的问题;目前常采用新型分子佐剂,如白细胞介素、干扰素、胸
腺肽和补体分子佐剂等是提高 DNA 疫苗免疫效果的重要措施,其中补体 C3d 分子佐剂
倍受人们的关注。
补体C3d分子是补体C3被抗原激活以后的最终裂解片段,能够促进抗原提呈细胞对
抗原的摄取、提呈作用,增强机体的免疫应答能力。因此,C3d 已经成为核酸疫苗有效
的新型分子佐剂。但是C3d 作为分子佐剂具有种属差异性,不同种动物间C3d免疫增强
作用的差异性需要作进一步的研究。
PRRSV GP5 基因编码的 GP5 蛋白为糖基化囊膜蛋白,该蛋白具有较好的免疫原性,
能诱导机体产生特异性体液免疫和细胞免疫。invH 基因是沙门氏菌 A-E 群的高度保守
基因,编码吸附和侵袭上皮细胞表面的蛋白,该蛋白决定沙门菌对肠粘膜细胞的侵袭力。
本研究首先对哺乳动物猪、鼠的 C3d 基因进行克隆及序列测定分析,并探讨了不同
种动物(猪、鼠、鸡、鸭)间补体 C3d 在基因水平上的相关性和差异性,然后以 PRRSV
GP5 为模型基因,利用鼠、猪(哺乳动物)C3d 的受体结合功能区 p28 和鸡、鸭(禽类
动物)C3d 的受体结合功能区 p29 作为分子佐剂,构建了 C3d-p28(29).n(n=2、4、6)
多聚体分子佐剂 PRRSV GP5 核酸疫苗和沙门氏菌 -invH-mC3d - 核酸疫
苗;用构建的核酸疫苗免疫小鼠并对其免疫效果进行了体液和细胞免疫主要指标的检
测,探讨不同动物 C3d-p28(29)对核酸疫苗的免疫增强作用。本研究主要包括四部分
内容:
1、哺乳动物猪、鼠补体 C3d 基因的克隆及序列分析:为了获得哺乳动物(猪、鼠)
的补体 C3d 基因克隆并比较同禽类动物(鸡、鸭)C3d 基因序列的差异性,首先从哺乳
动物鼠、猪的肝组织中提取总 RNA,通过 RT-PCR 扩增 C3d 基因的 cDNA,琼脂糖凝胶
电泳鉴定后直接克隆到 pMD18-T 载体,构建 pMD18-T-C3d 重组质粒,转化大肠杆菌,
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C3d 分子佐剂核酸疫苗的构建与免疫效果研究
酶切鉴定并进行序列测定,然后进行 C3d 序列和 CR2 结合区同源性比较分析。电泳结
果显示,分别在 936bp 和 888bp 处呈现明亮的条带,成功获得了鼠和猪的 C3d 基因克隆。
序列分析结果表明,哺乳动物(猪、鼠)和禽类(鸡、鸭)的补体 C3d 基因同源性仅为
64%;进化树显示,哺乳动物与禽类的亲缘关系越近,C3d 基因进化关系也越近。哺乳
动物(猪、鼠)与禽类(鸡、鸭)C3d 基因的 CR2 结合区比较分析发现,禽类为 29 个
氨基酸,而哺乳动物为 28 个氨基酸,两类动物该区氨基酸的同源性仅为 62%,而鼠、
猪两种哺乳动物之间、鸡、鸭两种禽类动物之间的同源性分别达 %和 84%,证明补
体 C3d 及 CR2 结合区具有种属的差异性。
2、不同动物 C3d 分子佐剂 PRRSV GP5 核酸疫苗的构建:为探明不同动物 C3d 分
子佐剂在核酸疫苗中的免疫增强作用,在上述试验克隆了动物 C3d cDNA 的基础上,设
计引物克隆 C3d-p28(29)至 pUC19 载体,利用同裂酶 BamHⅠ和 BglⅡ构建多聚体
C3d-p28(29).n,将其克隆至真核表达载体 (+)上;然后以 RT-PCR 扩增的 PRRSV
GP5 基因作为模式基因,定向克隆至真核表达载体 -C3d-p28(29).n 中 p28(29).n
上游,构建 -GP5-C3d-p28 (29).n 重组质粒。酶切结果显示,电泳后在 807、987、
1167bp 处分别出现了明亮的条带,表明成功构建了含有补体 C3