人脐血源基质细胞促进柔红霉素诱导耐药jurkat细胞凋亡及其机制的研究.pdf

第三军医大学硕士学位论文 7 人脐血源基质细胞促进柔红霉素诱导的耐药 Jurkat 细胞凋亡及其机制的研究摘要急性淋巴细胞白血病 (Acute lymphoblastic leukemia, ALL) 是一种淋巴造血组织异常增生性疾病,虽然目前的治疗手段能让大多数的患者得到完全缓解,但白血病复发率仍然很高。其复发的主要原因之一是白血病诱导化疗完全缓解 (complete remission, CR) 后,在体内残留微量白血病细胞,即微小残留病变 (minimal residual disease, MRD) 。大量研究表明白血病细胞赖以生存和增殖的骨髓造血微环境能够保护肿瘤细胞逃避化疗药物的杀伤作用,并认为这是 MRD 形成的一个重要原因。造血微环境 (hematopoietic inductive microenvironment, HIM) 是造血干/祖细胞在骨髓定居、增殖、分化、发育和成熟的场所,是支持和调节造血细胞生长发育的内环境,其发生异常,将导致或促进疾病的发生,如肿瘤。骨髓基质细胞是造血微环境的主要组成成分,它的异常必然导致疾病的进一步恶化。我们前期的研究表明白血病患者的骨髓基质细胞结构和功能也随之发生了改变,包括细胞因子分泌、粘附功能、细胞外基质成分都发生了异常,并证明白血病骨髓基质细胞有利于白血病造血细胞逃避化疗药物的杀伤。细胞增殖与凋亡的失衡是肿瘤发生机制之一, 并且与肿瘤细胞的转移和耐药相关。研究人员从生物治疗、化学治疗和中医治疗等各方面研究如何促进或诱导肿瘤细胞凋亡来控制和治疗肿瘤,并取得了可喜的成果。然而肿瘤复发一直是学者们所困扰的问题,特别是白血病微小残留病,它是许多白血病患者复发的主要原因,目前尚未发现有效、低毒、可行性强的治疗方法。本课题的目的之一即是为了探索能够长期有效控制或清除 MRD 的新的治疗手段。人脐血源基质细胞 (human umbilical cord blood- derived stromal cells, hUCBDSCs) 是本实验室首先发现并在体外分离培养出来的,经证明具备造血基质细胞的基本特征和造血调控的物质基础,并得到了国际同行的认可。本科室前期的研究还发现脐血基质细胞比骨髓基质细胞更原始,免疫原性弱, 造血重建能力也比骨髓基质细胞强,此外还发现前者促进残留耐药细胞凋亡的作用强于后者。为了深入探讨人脐血基质细胞促凋亡的机制,本课题在构建柔红霉素(daunorubicin, DNR) 诱导的耐药 Jurkat 细胞第三军医大学硕士学位论文 8 (Jurkat/DNR 细胞) /hUCBDSCs 共培养模型的基础上,体外观察 hUCBDSCs 对 Jurkat/DNR 细胞抑制增殖和促凋亡的作用。从死亡相关蛋白激酶 1 (Death-Associated Protein Kinase, DAPK1) 和 DAPK1 调节的基因途径深入探讨 hUCBDSCs 促进 Jurkat/DNR 细胞凋亡的可能机制,为清除白血病 MDR ,减少白血病复发提供新的辅助治疗方法。研究内容及方法: 1. 正常骨髓基质细胞微环境对 Jurkat/DNR 细胞凋亡的影响实验分组:① Jurkat/DNR 细胞/白血病 hBMSCs 共培养组;② Jurkat/DNR 细胞/ 正常 hBMSCs 共培养组; CCK-8 法检测 Jurkat/DNR 细胞增殖特性的变化; Caspase-Glo3/7 活性、 RT-PCR 法检测不同培养条件和不同时相点 Jurkat/DNR 细胞的凋亡相关指标。 2. DAPK-1 途径在人脐血源基质细胞促进残留耐药 Jurkat 细胞凋亡中的作用实验分组: ① Jurkat/DNR 细胞/白血病 hBMSCs 共培养组; ②Jurkat/DNR 细胞/ 正常 hBMSCs 共培养组; ③Jurkat/DNR 细胞/ hUCBDSCs 共培养组; CCK-8 法检测 Jurkat/DNR 细胞的增殖特性; Northern blot 法、 Real-time Q-PCR 法、 Western blot 法检测 Jurkat/DNR 细胞的凋亡相关指标。结果: 1 .正常骨髓基质细胞微环境对 Jurkat/DNR 细胞凋亡的影响 增殖曲线:正常 hBMSCs 对 Jurkat/DNR 细胞的增殖抑制作用强于白血病 hBMSCs ; caspase 3/7 活性:正常 hBMSCs 促进 Jurkat/DNR 细胞 caspase 3/7 活性增强; 正常 hBMSCs 促进 Jurkat/DNR 细胞凋亡: bcl-2 mRNA 表达减少, DAPK1 表达增加, bax 表达无差异。 2. DAPK1 途径