RNA-提取琼脂糖电泳及RTPCR1.ppt

RNA-提取琼脂糖电泳及RTPCR1
目的 DNA片段
质粒
TA载体
重组质粒
目的 DNA
转化
死亡
存活
含抗生素培养基中生长
PCR
2-3min
实验二 RNA提取、逆转录PCR
实验内容
1、小鼠肝脏组织总RNA的提取；
2、RNA的琼脂糖凝胶电泳；
3、以总RNA为模板的逆转录反应；
4、以cDNA为模板的特定基因的RT-PCR:
注：本次实验扩增GAPDH基因(746bp)
5、 PCR产物的电泳及回收
（8：05~8：15）
教师要有下午电泳时 播放的多媒体 PCR Flash 动画 PCR在法医学上的应用
RNA提取操作注意事项
RNA分离的关键因素是减少RNA酶污染。
RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。

1、尽量避免外源性RNase 污染
a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。
b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）
。
、水都应该经过去RNase 处理。对玻
璃器材还应该进行高温烘烤。
2、应用RNase 抑制剂抑制内源性RNase 活性。
总RNA

真核细胞的RNA主要分为：
1、mRNA: 1-5%
起始密码：AUG 终止密码：UAA,UAG,UGA。
5`鸟嘌呤7位甲基化—CH3修饰。
1）免受核酸酶破坏，
2）起始、促进蛋白质合成。
3`poly(A)尾巴结构 20--200个A. 翻译所必需。

2、tRNA: 10-15%
3、rRNA: 80-85%
大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt =160nt
小亚基40S: 18S=1874nt
1）将1 ml Trizol 试剂分装到Eppendorf 管中备用。
2）实验教师操作: 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大,放在玻片上立即研磨,研磨要彻底。
3）将研磨后的组织（小米粒大小）转移至1 ml Trizol 试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。
4）室温孵育10 min。
（8：15~9：05）
发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。
强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。
第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA
1、异硫氰酸胍法：
GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总RNA。
特点：需低温操作，但价格经济。
2、Trizol 试剂（商品化产品）
特点：在室温下可以提取细胞总RNA，
具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。
3、mRNA提取试剂盒
真核细胞mRNA的3末端有ploy(A)尾，利用寡聚 dT纤维素结合mRNA，将其从细胞总RNA中分离出来。
课间介绍 RNA提取的几种方法
室温孵育10 min
RNase抑制剂介绍
1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐
RNA操作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。
使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中
所有液体试剂都应该用DEPC处理。
有效浓度：%---%，室温磁力搅拌20分钟。
灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。