第二十二章高效液相色谱法第一节概述高效液相色谱法( high performance liquid chromatography, HPLC )是 20世纪六十年代末在经典液相柱色谱法的基础上引入了气相色谱的理论和技术,采用高压泵、高效固定相以及高灵敏度检测器发展而成的分离分析方法。第一节概述经典柱色谱法流动相是在常压或低压下运行,传质速度慢,所用固定相颗粒粗,柱效低, 分离时间长;色谱柱不能连续使用;样品用量大,灵敏度低;除了用于制备分离外,不能在线检测。 HPLC 和 GC 的基本理论一致,定性定量原理完全一样,均可用计算机控制色谱条件和色谱的处理程序进行在线检测。第一节概述 HPLC 和GC的不同点为: ①流动相不同: GC用气体做流动相,载气种类少,性质接近, 改变载气对柱效和分离效率影响小。 HPLC 以液体做流动相,且液体种类多,性质差别大,可供选择范围广,是控制柱效和分离效率的重要因素之一; ②固定相差别: GC多是固体吸附剂或在担体表面上涂渍液体固定相,且粒度粗。 HPLC 大都是新型的固体吸附剂、化学键合相等,粒度小(一般为 3~10μm); ③使用范围更广: GC主要用于挥发性、热稳定性好的物质的分析。因此, GC只能分析占有机物总数 15% ~20% 的物质。 HPLC 可分析高沸点、难挥发和热不稳定的化合物、离子型化合物和高聚物乃至生物大分子等物质。第一节概述 HPLC 采用高灵敏度检测器,如紫外检测器的最小检测量可达纳克(10 -9g)级、荧光检测器的灵敏度可达 10 -11g。HPLC 的特点: 分离效率高、分析速度快、灵敏度高、色谱柱可反复使用、流动相可选择范围宽、流出组分容易收集、操作自动化、适用范围广。第二节高效液相色谱仪高效液相色谱技术得到迅速发展,基本原理和色谱流程都是相同的,仍然由流动相输送系统、进样系统、色谱分离系统、检测记录数据处理系统组成。溶剂贮器 1中的流动相经混合室 2混匀,被泵 3吸入,然后输出,导入进样器 5。被分析样品用注射器 6由进样器处注入,并随流动相一起依次通过预柱 7、色谱柱 8后进入检测器 9。检测信号经过数据系统 10处理,记录色谱峰面积和色谱图。若是制备色谱,可以使用馏分收集器 11。复杂样品采用梯度洗脱(借助于梯度控制器 4)使样品各组分均得到最佳分离。整个仪器可由微处理机操纵,包括数据处理和操作控制。液相色谱仪( 2) 第二节高效液相色谱仪一、输液系统(一)流动相贮器流动相贮器俗称贮液瓶,它对大多数有机化合物呈化学惰性,耐酸碱腐蚀。常见质地为玻璃或塑料, 容量约为 ~ ,通常无色透明,若流动相需避光,有棕色瓶供选择。贮液瓶放置位置要高于泵体,以便保持一定的输液静压差。使用过程贮液瓶应密闭,以防溶剂蒸发引起流动相组成的改变和防止空气中的 O 2、CO 2重新溶解于已脱气的流动相中。第二节高效液相色谱仪(二)脱气装置流动相在使用前必须进行脱气处理,目的是除去其中溶解的气体。在装入贮液瓶之前必须经过 μm滤膜过滤。为了使溶剂便于脱气,贮液瓶常需贮备抽真空及吹入惰性气体装置。在洗脱过程中如存在气泡会增加基线噪音,严重时使分析灵敏度降低。此外溶解在流动相中的氧气,会造成荧光猝灭,影响荧光检测器的检测,还可能导致样品中某些组分被氧化或使柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。常用的脱气方法有如下几种:
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