葡萄ERF基因的克隆及功能分析.pdf

辽宁师范大学硕士学位论文葡萄ERF基因的克隆及功能分析姓名:林轶申请学位级别:硕士专业:植物学指导教师:侯和胜 20090501 葡萄BRF基因的克隆及功能分析捅要盐碱、低温和干旱等逆境胁迫是限制植物生长发育的重要因子,也是影响作物产量的主要胁迫因素。在逆境胁迫条件下,植物首先要通过多种途径感应环境的变化,然后将环境变化转变为细胞内部的信号,在接受了细胞的内部信号后,转录因子等反式作用因子与顺式作用元件结合来启动抗逆基因的表达,从而提高植物的抗逆性。许多植物逆境胁迫诱导基因的表达都在转录水平上受到转录因子和顺式作用成分的调控,因此转录因子在植物抗逆信号传递过程中起着中心调节的作用。本文主要分两部分对葡萄的转录因子删行研究: ,对TIGR葡萄基因数据库进行搜索,从中获得了9个包含 AP2/ERF结构域的全长ORF序列。应用生物信息学的方法对这9个基因进行了如下的分析: 1)运用生物信息学的方法和工具对其核酸和氨基酸序列进行进一步的分析,在对它们的组成成分、信号肽、磷酸化位点、三级结构、基因组中定位的信息及功能结构域的预测等表明:这9个基因均含有完整的AP2/ERF结构域,除了册』、ERF2-2、ERF3c 外,都具有信号肽序列,并且每个基因都有多个丝氨酸磷酸化位点; 2)将这9个基因与确定的拟南芥瞒因序列进行比对及系统进化树分析表明,臁族成员AP2/ERF结构域在葡萄和拟南芥中是非常保守的,并且每个预测的葡萄中嬲因均与拟南芥的腿因有不同程度的相似性,这为我们研究葡萄ERF基因的功能提供了方向。此外,我们获得了VvERF2-2,VvERF3a、VvERF3b、VvERF3c、№蹴圈o 54"基因的克隆,为下一步研究打下基础。 ,我们以VvERF3a、阮脚蜊个基因为研究对象进行了下列研究: 1)采用半定量的方法,分别研究了VvERF3a、蹄解缅塞两个基因在高盐胁迫条件下的诱导表达模式,以及它们对植物激素SA、ABA、ET的响应情况。结果表明:VvERF3a 和瞻磁雠因均受ET、ABA和SA的诱导,但不响应盐胁迫。这也暗示了,它们可能参与了SA、ABA、ET的信号响应途径。 2)通过酵母激活实验确定了VvERF3a、№磁腿因的转录激活活性。实验表明: VvERF3a、阮6艘了堪因与GAL4一BD融合,在酵母表达系统内能激活报告基因的表达, 转化酵母后能在SD/-Trp—His—Ade培养基上生长,说明这两个基因具有转录激活活性。 3)为了进一步研究VvERF3a、愀勋基因的功能,我们构建了VvERF3a、№醐燃两个基因的超表达载体,通过农杆菌介导法分别获得了VvERF3a、%嘲站基因的超表葡萄翻F基因的克隆及功能分析达转基因拟南芥株系。综上所述,本研究通过电子克隆获得9个厥风基因,并克隆了其中5个基因,进一步对VvERF3a、№麟嬲因的分子生物学特征进行分析,并获得了它们的超表达转基因植株,为更进一步研究这两个基因的功能奠定了基础。关键词:葡萄,拟南芥,转录因子,ERF,逆境胁迫葡萄ERF基因的克隆及功能分析一———————————-———————————___———_--l—_———_●—————●●—●——_一 Abstract Plant growth and productivity are strongly influenced by abiotic stress such as drought,high salinity or low stress conditions,plants firstly sense the environmental changes trough many ways,and then transfer these changes into the cell as signals,and then transcription factors accepted these cell signals will act with cis-acting elements and regulate the expression of stress responsive genes,which will then result in an enhancement of stress—tolerance ,transcription factors play apivotal role in stress tolerance of plants. Inthis research,the plant stress tolerance—related genes were inves