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Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统试剂盒内容物: Introduction : Overview : Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒(杆粒) 的位点特意转座子的表达框的质粒在 Ecoli 中扩增。 Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统主要包括: *pFastBac 捐献质粒的选择, 它要能够产生包含目的位点的表达结构, 这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控制。* 一个 Ecoli 宿主, DH10Bac , 包含杆状病毒质粒( 杆粒) 和辅助质粒, 在转染 pFastBac 表达结构后可以产生重组杆粒。* 一个控制表达的质粒,包括 Gus 和/或 CAT 基因,以便在感染细胞后产生重组杆状病毒,表达β- 葡萄糖酸酐酶和/或氯霉素乙酰转移酶。 Bac-to-Bac 表达系统的优点: 使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优点: * 与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的 4-6 周相比,鉴别纯化重组病毒少于两周* 减少了从斑点筛选重组病毒 DNA 所包含亲缘和非重组病毒的几率* 可以快速同时进行大量重组,适合表达功能性研究的蛋白选择 pFastBac 菌体( Vector ): 大量的 pFastBac 菌体都适于进行 Bac-to-Bac 表达系统。选择对于你的需要最合适的菌体。 Vector 特点参考 pFastBac TM1 高水平表达的强 AcMNP V聚乙烯( PH )启动子用于简单克隆的大量克隆位点 Anderon 1996 pFastBac TM HT 高水平表达的聚乙烯启动子; N- 末端含有 6XHis , 可以用来纯化重组蛋白,并可用 TE V 蛋白酶切去; 提供 3 个阅读框 Polayes 1996 pFastBac TM Dual 两个强启动子( PH 和 p10 ) Harris 和 Polaye 1997 可以同时表达两种蛋白; 两个大的克隆位点指南用途: 指南提供了一个对于 Bac-to-Bac 表达系统的概述,并对以下提供指导: 1、克隆目的基因到 pFastBac TM 供体质粒的选择 2、转化 pFastBac TM 结构到最高效的 DH10Bac TM 产生重组质粒 3、转染重组质粒 DNA 到昆虫细胞产生重组杆状病毒 4、扩增滴定( Amplify and titer )杆状病毒株,使用病毒株感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的: Bac-to-Bac 杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组杆状病毒,在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽然他可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白,但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知识。 Bac-to-Bac 表达系统表达系统的成分: 表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于 Luckow1993 年的方法,此系统利用了位点特意的专座子 Tn7 区简化和提高重组质粒 DNA * 系统的第一个成分是用来克隆目的基因的 pFastBac TM 菌株。基于 pFastBac TM 菌株的选择, 表达基因被 AcMNPV 的PH 或 p10 启动子控制,在昆虫细胞内高水平表达表达框被 Tn7 的左右臂包围,并且包含一个庆大霉素抗性点和 SV40 多腺苷酸化信号,形成一个微型的 Tn7 * 第二个主要结构是 Ecoli 的 DH10Bac TM 品系, 用来作为 pFastBac TM 菌株的宿主。 DH10Bac TM 细胞包含带有微型-attTn 7 靶位点的病毒质粒和辅助质粒( 详细见下文)。一旦 pFastBac TM 表达质粒转入 DH10Ba c 细胞, 转化就会发生在 pFastBac TM 菌株的微型 Tn7 单位和微型-attTn7 的靶位点之间产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白处。如果你已经完成了转化反应, 你需要分离这个高分子量的重组质粒 DNA 并将质粒 DNA 转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病毒,用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后,高效价的病毒株可以用来感染细胞,进行大规模的重组蛋白的表达。杆状病毒菌株: 病毒菌株(杆粒), bMON14272(136KB) ,在 DH10Bac Ecoli 中包括: * 一个低拷贝的微型 F 复制子* 卡那霉素的抗性标记* 一个来自于 pUC 载体的编码 LacZa 肽的 DNA 片段,用来接触病毒转座子, Tn7 (微型 attTn7 )已经被插入。插入的微型 attTn7 不会中断 LacZa 肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒 Ecoli DH10Bac 中扩增, 在显色物质如