吴茱萸碱对创伤小鼠脾脏树突状细胞的调节作用的研究.pdf

第三军医大学博士学位论文吴茱萸碱对创伤小鼠脾脏树突状细胞的调节作用研究摘要目的: 创伤是严重威胁人类生命和健康的原因之一。严重创伤后机体免疫功能紊乱可导致感染和多器官功能障碍综合征的发生,对其研究有助于揭示创伤并发症的发生机制并指导临床治疗。树突状细胞(ell,DC)作为专职的抗原呈递细胞在启动和调节天然及适应性免疫应答中具有关键性的作用。研究表明,严重创伤所致DC功能异常可进一步导致伤后免疫功能紊乱,但迄今尚无有效逆转措施。吴茱萸碱(evodiamine, EVO)具有明确的抗炎活性,但对DC功能的调节作用尚不清楚。本研究拟探讨EVO体内应用对创伤小鼠脾脏DC的影响及其可能的调节机制,为开发更加有效的创伤后免疫功能调节剂奠定基础。方法: 1、制备Balb/ctJ',鼠创伤模型(闭合性股骨骨折+失ga),致伤后立即对小鼠腹腔注射 EVO(10mg/kg),1次/天,连续4次。伤后第4天分离脾脏DC细胞,流式细胞术检测脾脏DC(CDl 1c+)数量、DC表面MHC II及共刺激分子CD40、CD80幂ICD86的表达:ELISA 检测LPS刺激的DC培养上清***@IL一6、【、、;以混合淋巴细胞反应检测DC诱导异源T细胞的增殖能力。 2、流式细胞术检测脾脏DC的凋亡发生率;小鼠细胞因子抗体芯片检测外周血清细胞因子水平。 3、实时定量PCR检钡fJDC细胞芳香烃受体(AhR)和CYPlAl mRNA水平。 4、分子模拟方法检测EVO与AhR的相互作用。结果: 1、与对照组相比,创伤组小鼠脾脏DC(CDl lc+)数量、DC激发异源T细胞增殖的能力明显降低(尸<),DC的MHC II、CD40、CD80表达及其在LPS刺激下的 TNF一0L、IL一6、IL-12p40、IL-12p70的分泌均明显减少沪<),EVO治疗可明显促进创伤组DC数量的恢复,并明显提高其激发异源T细胞增殖的能力(P<);但对第三军医大学博士学位论文创伤组小鼠脾脏DC的MHC II、CD40、CD80表达降低以及TNF-0【、、IL-12p40、 >)。 2、与对照组相比,创伤小鼠脾脏DC的早期凋亡(Annexin V+PI一)和晚期凋亡(AnnexinV+PI+)发生率均明显增2N(P<),而EVO治疗可明显逆转该变化,使DC 的早期凋亡和晚期凋亡发生率接近到对照组水平俨<)。小鼠外周血清细胞因子检测结果显示,创伤组/sham组,,分别是Eotaxin、 、GCSF、、KC、、MIG、RANTES、、、Dtk、IGFBP-2、 IGF-II、MDC、MMP一2、Osteoporotegerin、Pro—MMP-9、 Resistin、Thymus CK-1, ,分别是Axl、BLC、CD30T、CD40、、CXCLl6、 GM—CSF、IFN-Y、IGFBP-3、IGFBP-5、IGFBP一6、IL-2、IL·4、IL-5、IL-9、IL-10、 IL-12 p40/p70、IL-12 p70、IL-17、Leptin R、LIX、MIP一2、PF-4、P—Selectin、SCF、 TNFa、sTNF RI、sTNF RII、TPO、VCAM-1、bFGF、Fit·31igand、IGF-I、IL一15、 IL一17BR、IL-7、I-TAC、Lungkine、MMP-3、Osteopontin、Shh—N、TIMP-2、TRANCE、 TROY、TSLP、VEGF R1、VEGF R2、VEGF R3、;创伤+EVO治疗组/创伤组,,分别是BLC、、、、Dtk、 Fcgamma R B、GITR、HGF R、ICAM-1、IGFBP-2、IGF—I、IGF-II、IL一15、IL一17BR、 IL-7、I-TAC、Lungkine、Osteopontin、Shh—N、TIMP-2、TSLP、VEGF R1、VEGF R2、 VEGF R3、,,、KC、、 MDC。 3、与对照组比较,创伤小鼠脾脏DC的AhR mRNA、CYPlAl mRNA水平均降低(P<),而EVO治疗后两指标水平降低更甚,且明显低于创伤组值(尸<)。 4、采用同源模拟的方法,建立了AhR结合区域的蛋白质三维结构,经Verify3D 评价,该