可拆分获得手性药物（s）-酮基布洛芬基因工程菌构建及性质鉴定.pdf

摘要中文摘要利用生物系统获得光学纯化合物已经逐渐成为化学合成方法之外的另一选择。2一芳基丙酸类药物是一类重要的非甾体抗炎药。利用微生物中脂肪酶立体选择性的拆分,获得具有光学活性的2一芳基丙酸类药物(如:酮基布洛芬和奈普生)的单一对映体已成为该研究领域的热点之一。本文以本实验室筛选出的具有一定不对称转化外消旋酮基布络芬氯乙酯生成(S)一酮基布洛芬能力的菌株NKl3。及从该菌2~6kbp大小DNA片断的基因组文库中筛选得到的含酯酶基因的转化子为材料,通过亚克隆构建了一株表达重组菌,采用水解三丁酸甘油酯的透明圈法筛选到了目的克隆。经PCR扩增、克隆和核苷酸测序,并将测序结果与Genbank中已知基因序列进行同源性比对,证明亚克隆得到的酯酶属首次发现,提交GENBANK,注册号为:DQl96347。提取的克隆质粒中包含完整的酯酶可读框长933bp,编码3lO 个氨基酸,分析表明该酯酶为疏水的酸性蛋白。利用Phenyl sepharosecL-4B疏水柱层析柱取代了昂贵的Ni柱进行蛋白分离纯化,经SDS—PAGE电泳检测证明疏水层折纯化到了单一的34J(Da酯酶蛋白。实验中以不同浓度的IPTG和乳糖作为诱导剂,进行了比较,发现了低浓度的外消旋乳糖同样可以诱导表达菌株大量产酶;同时,质粒的稳定性实验,证实了连续遗传100代后,表达菌株中的pET-NKestl质粒稳定性仍高达9096以上, 这些对于工业生产都有着非常重要的实际意义。薄层层析与HPLc检测结果显示,表达菌株的转化效率明显提高,%的酮基布洛芬氯乙酯到表达菌45分钟就能转化 %,而得到的(S)一酮基布洛芬过量(.%)%(%,%),是原始野生型Nl(13’菌株转化光学纯度 .%(%),充分说明了该酯酶具有优先拆分得到s一酮基布洛芬的特性。如果能对表达重组菌生长条件及转化底物时的条件(pH、温度、转化率等)进一步优化,将有望得到更高光学纯度的S一酮基布洛芬。借助不同的网络服务器和生物学软件分析了该酯酶蛋白的一级结构、二级结构,探讨了酯酶的高级结构与功能,初步分析说明了该酯酶N’端的203位一点的氨基酸残基,可能是影响酶蛋白拆分手性药物能力的关键位点。如果能进一步通过人工合成特定碱基序列、表达出具有专一性拆分得到S一酮基布洛芬能力的酯酶,从而通过实验证实影响酯酶光学纯拆分能力的活性位点,必将对研究包括酮基布洛芬在内的许多手性药物的生物酶法拆分起到极其重要的指导意义。关键词:酮基布络芬酯酶/脂肪酶手性拆分生物信息学疏水层析 Abs订act AbstraCt 111e application ofbiolo百calsystelns蠡时producti∞ofo面cally polllldsh硒be咖e ana1姗埘ve to c1勰sicalmemodolo百es ofcheIIlical -A01propiollic ∞ids are 趾impor叫 cI嬲s ofnon-咖idal en趾tio∞lective resolution of2-Arylpropiollic觚ids such鹤Ketoprof醣锄d Nap∞暇e11 for tlleiropdcally activeer眦tiomers by lipa∞眈st眦se丘Dm 姐isms iscl|I僦ly asubject ofintensiveiIlVestigations cmTently. A straillNKl3 had been screeIled whichc觚e)【tent酗yIr皿砌c hydrolyze me rac-K咖profen Chloroethyle船to(S)一Ke幻p∞fen for ac吼Iin Atmes锄e tiIne,a 衄1sfomlant covefing e蛐;m∞gene lladbeen isolated丘omch舢osomal DNA li觚ID『contailling meDNA加gm锄协of 2^ noVel bi瑚m (DE3),pET-NKestl ess矗dly cons仉lcted forhi曲expression ofest咖e by gcne doning done prodl| anew esterase w嬲dete曲ed due t0tlle fo蚰ation of halos around thecoloIlies on LB ag盯plates supplemen舱d