真核细胞rna提取实验报告.docx

真核细胞rna提取实验报告.docx真核细胞 rna 提取的实验报告
篇一：真核细胞 RNA的提取
一．原理
本方法利用盐酸胍抑制 RNA酶，匀浆裂解细胞， 采用有机溶剂抽提
去除蛋白质。通过选择性沉淀 RNA分子去除 DNA。
二．方法
样品处理
⑴组织样品处理：取新鲜的组织样品称重后，剪碎成约 1cm2的组织块直接加入匀浆液中进行 RNA提取，或液氮中速冻 -70 ℃保存。
⑵贴壁培养细胞处理： 用 PBS洗细胞一次， 吸干溶液后将培养板快速移至液氮中冷冻后转到 -70 ℃保存；或加入 1ml 匀浆至培养板中直接裂解细胞，然后将粘稠的裂解液进一步匀浆。
⑶悬浮培养细胞处理： 离心收集细胞，用 PHS悬浮漂洗再田心收集，若不立即提取 RNA，则可经液氮速冻后转至一 70℃贮存备用。
2 ．加 l 倍体积盐酸胍匀浆液 [ 至准备好的样品细胞中，高速匀浆
1min。
3
．匀浆液 5000g，室温离心 10min。
4
．将上清移至一个干净离心管中，加入 体积的 3mol／L 乙酸
钠，混匀，再加 5 体积预冷的乙醇，立即充分混匀， -20 ℃放置至少
小时。
．5000g 0 ℃离心 10 分钟沉淀核酸，弃上清液，室温干燥。
，每个提取 RNA的组织或细胞样品中，加入 l0 ～15min 盐酸胍匀
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浆液Ⅱ，搅拌溶解。
7 ．加入 体积预冷的乙醇，立即充分混匀， -20 ℃至少放置 2 小
时。
．5000g 0 ℃离心 10 分钟沉淀核酸，去上清，室温挥发乙醇。
9 ．按每克组织细胞加 5min 的比例．分两次加入 ／ L
EDTA() 先加 1／2 体积 EDTA振荡 l ～2 分钟，3000g离心 2min．吸出上清．再加另一个 1/2 体积的 EDTA振荡 l 一 2 分钟．合并两次核酸溶解液。．
．用等体积氯仿—正丁醇 (4 ：1) 抽提核酸溶液， 5000g 室温离心
l0min ，5000g 室温离心 10min。吸出上清至另一个干净离心管中。
11 ．加 3 倍体积 lmol ／L 乙酸钠 () 混匀， -20 ℃放置 1h 以
上，此时 RNA将选择地沉淀，而 DNA仍为溶解状况。
．5000g，0℃离心 20min，沉于管底的是 RNA。
．吸去上清，用 4℃预冷的 lmol ／L 乙酸钠 (pH7．0) 漂洗 RNA沉淀。然后 20℃ 5000g ，离心 20 分钟。回收 RNA。
．尽量去除上清液。按每 g 组织细胞 1m的比例加入 RNA溶解液
( ％SDS， ％mol／L EDTA，) 。注意：若有 SDS沉淀析出．滴
加 ／L NaOH调溶液 pH至 7．5。
15 ．加入 2 倍体积冰预冷乙醇混匀， 0℃放置至少 2 小时， 5000g，
4℃离心 10 分钟， RNA沉淀用 70％乙醇漂洗，短暂离心后，弃上清，
室温干燥蒸发乙醇。
16 ．用适当小容积 DEPC处理过的 ddH2O溶解 RNA沉淀，加入 3 倍
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体积乙醇，
-70 ℃保存 RNA备用。用时．加入 体积的 3mol／L 乙酸钠，混
匀， 120xxg，4℃离心回收 RNA。
三. 试剂
1 ．盐酸胍匀浆液Ⅰ
成分：8mol／L 盐酸胍 ( 分子量为 ) ，O．1mol／L 乙酸钠 (pH5．2) ，5mmol／L 2 —巯基乙醇， ％十二烷基肌氨酸钠
配制方法：取 191g 盐酸胍．加 3mol／L 乙酸钠 (pH5．2)和 6．25ml 0 ．2mol／L 2 —琉基乙醇溶液中，再加水至 237．5ml，混匀后加 12．5ml 10 ％十二烷基肌氨酸钠 , 振荡混匀溶解。
．盐酸胍匀浆液Ⅱ
成分： 8mol ／ L 盐酸胍 ( 分子量力 ), ／ L 乙酸钠
(pH5．2),1mmol ／L 2