基因克隆步骤完整版.docx

总 RNA 提取
液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1ml Trizol 加到离心管中待用
(2)将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；打开离心机预冷
(3)力口 200小氯仿，振荡15 sej室温放置3 min,分层；
(4) 4°C, 12,000g,离心 15 min；
(5)取上清，加500以异丙醇，混匀，室温放置10 min；
(6) 4°C, 12,000g,离心 10 min；
(7)弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用 100%乙醇清洗
(8) 4°C, 7,500g,离心 5 min；
(9)弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 L DEPCC,
－ 80oC 保存。
此操作中所用到的器皿均需经过 DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA需经RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。 OD260值为核酸的吸收值，OD280值为
蛋白的吸收值，OD260/280值在问一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内， 可正常使用；
此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸 OD260/230值能达到左右。
RNA浓度计算公式：总RNA浓度(Ng/mL =A260淅释倍数M0。
2 反转录 /cDNA 第一链的合成
纯化RNA以去除基因组 DNA ,操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time说明书进行。其体系为：
Total RNA 1 g
5X gDNA Eraser Buffer 2^1
gDNA Eraser 1 L
RNase Free dH2O 补齐至 10^1
条件为： 42oC， 2min ；
RNA 纯化后，即可进行反转录。其体系为：
5 x PrimeScript Buffer 2 (for Real Time) 4 仙 L
PrimeScript RT enzyme mix I 1 仙 L
RT Primer Mix 1 L
上一步的反应液 10 nL
RNase Free dH2O 补齐至 20 a L
操作条件为：
(1) 37oC 放置 15 min； (2) 85°C, 5 sec； (3) 4oC 保存。
PCR
按TaKaRa公司的Premix Taq Version操作，，PCR反应体系如下:
Premix Taq 25 仙 L
模板 5^L
引物 1 (10 nM) 1
引物 2 (10 nM) 1
ddH2O 18M
PCR 反应条件为： 94°C 预变性 5min ； 94°C 变性 30s， 53°C 退火 30s， 72°C 延伸
30s,循环 36 次；72° C延伸 10min。
PCR反应完毕，取5反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳(若割胶回收则用10 反应产物) 。
基因克隆及测序
PCR 产物切胶回收
将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳，在紫外灯下观察并切下预期大小的 DNA
片段。 使用 TIANGEN 公司的 Universal DNA Purification Kit 割胶回收试剂盒进行纯化， 步骤如下：
(1)平衡吸附柱：