实验10双缩脲法测定蛋白质含量.ppt

实验十双缩脲法测定蛋白质浓度一、实验目的 1. 学习常见蛋白质含量测定的原理和方法 2. 掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法二、原理一、分光光度法的基本原理及方法(一)利用吸收光谱对物质进行定性分析维生素 B 12溶液的吸收光谱主要方法: (1)比较吸收光谱曲线(2)比较最大吸收波长蛋白质的最大吸收波长为 280nm ; 核酸的最大吸收波长为 260nm 。(3)比较吸光度的比值纯 DNA : 280 260? nm nmA A (二)利用吸收光谱对物质进行定量分析 Beer-Lambert (比尔)定律: T=I/I 0 A=lg1/T=lgI 0 /I A= ε cl 其中: T 为透光率; A 为吸光率; I 0 为入射光强度; I 为透射光强度; ε为摩尔消光系数; C 为溶液浓度; L 为溶液光程的厚度 (1)标准曲线法?标准曲线与样品的测定条件必须一致。(2)标准管法 C X /A X =C S /A S,已知 C S,测定 A S、A X可求得 C X。(3)摩尔吸光系数法 C=A/ ?(?为 L=1cm ,C为 1 mol/L 时的吸光系数,也称为摩尔吸光系数。微量凯氏定氮法测定蛋白质总含量被测的天然含氮化合物与浓硫酸共热时分解出氨,氨与硫酸反应生成硫酸铵。在凯氏定氮仪中加入强碱碱化消化液,使硫酸铵分解出氨。用水蒸汽蒸馏法将氨蒸入无机酸溶液中,然后再用标准酸溶液进行滴定,滴定所用无机酸的量(mol) 相当于被测样品中氨的量( mol ),根据所测得的氨量即可计算样品的含氮量。因为蛋白质含氮量通常在 16 % 左右,所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数 ,便得到该样品的蛋白质含量。 Folin- 酚试剂法(Lowry 法)测定蛋白质浓度蛋白质含有两个以上的肽键(— CO — NH —), 因此有双缩脲反应,在碱性溶液中,能与 Cu 2+ 形成络合物。 Folin 酚反应是在双缩脲反应的基础上,引进 Folin 试剂( 磷钼酸—磷钨酸试剂) ,蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂,生成蓝色物质。在一定条件下,蓝色强度与蛋白质的量成正比例。本法的优点是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏 10—20 倍,较双缩脲法灵敏 100 倍。其不足之处是此反应受多种因素干扰。( Tris 缓冲剂、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物、酚、柠檬酸)。