土壤酶的测定方法.doc

一、脲酶测定( 比色法) 脲酶是对尿素转化起关键作用的酶, 它的酶促反应产物是可供植物利用的氮源, 它的活性可以用来表示土壤供氮能力。 1 、试剂配制: (1) pH6. 7 柠檬酸盐溶液:取368 g 柠檬酸溶于600m L 蒸馏水中,另取295 g 氢氧化钾溶于水, 再将两种溶液合并,用1N 氢氧化钠将 pH 调至 , 并用水稀释至 2L 。(2) 苯酚钠溶液: 称取 苯酚溶于少量乙醇中,加 2mL 甲醇和 L 丙酮,后用乙醇稀释至 100mL (A液) ,保存再冰箱中。称取 27g 氢氧化钠溶于 100mL 水中( B液) ,保存于冰箱中。使用前,取 A、B 两液各 20mL 混和,并用蒸馏水稀释至 100mL 备用。(3) 次氯酸钠溶液:用水稀释制剂至活性氯的浓度为 %,溶液稳定。(4)10 %尿素溶液: 10g 尿素溶于 100mL 水中。(5)N 的标准溶液: 精确称取 硫酸铵溶于水稀释至 1L , 则得 1m L 含 的标液, 再将此液稀释 10 倍制成氮工作液( )。 2 、操作步骤称取 5 g土置于 50m L 容量瓶中,加 1m L 甲苯处理, 加塞塞紧轻摇 15 min ; 往瓶中加入 5mL10% 尿素液和 10mL 的柠檬酸盐缓冲液( pH ), 仔细混匀。在 37℃恒温箱中培养 24h。然后用热至 38℃的蒸馏水稀释至刻度( 甲苯应浮在刻度以上), 摇荡, 将悬液过滤。取滤液 1m L置于 50m L 容量瓶中, 用蒸馏水稀释至 10mL, 然后加入 4mL 苯酚钠溶液, 并立即加入 3mL 次氯酸钠溶液, 加入每一试剂后,立即将混合物摇匀,20 min后, 将混合物稀释至刻度, 在波长 578 nm处测定吸光值。脲酶活性以样品所得的吸光值减去对照样品吸光值之差, 根据标准曲线求出氨态氮量。标准曲线绘制: 分别取 0、1、3、5、7、9、 11、 13mL 氮工作液置于 50mL 容量瓶中, 加蒸馏水至 20mL , 再加 4mL 苯酚钠溶液和 3mL 次氯酸钠溶液, 随加随摇匀, 20min 后显色,定容。 1h 内再分光光度计上于 578nm 处比色。 3 、结果计算以24 小时后 1g 土壤中 NH 3-N 的质量( mg )表示脲酶活性( Ure ) Ure =a·V· n/m 式中:a 为由标准曲线求得的 NH 3-N 浓度( mg/mL );V 为显色液体积( 50mL ); n 为分取倍数; m 为烘干土重( g)。二. 过氧化氢酶测定( 容量法) (比较好测) 1. 试剂配制 a. %过氧化氢溶液:按 1:100 将 30%H 2O 2 用水稀释 b. 3N 硫酸( ??????????? ) c. 高锰酸钾( 1/5KMnO4 )溶液:称取化学纯高锰酸钾 ,溶于 1 升无 CO 2 蒸馏水中,贮于综色瓶中,备用。 2. 操作步骤(1 )取 2g 风干土,置于 100mL 三角瓶中,并注入 40mL 蒸馏水和 5mL %H 2O 2 溶液。(2) 同时设置对照, 即三角瓶中注入 40mL 蒸馏水和 5mL %过氧化氢溶液, 而不加土样。(3) 将三角瓶放在振荡机上振