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翻译好的-罗氏公司Tunel试剂盒操作说明书
罗氏(Roche)公司Tunel试剂盒操作说明书
(In situ cell death detection kit-POD法)
一、 原理：
TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂DNA的3’-OH末端，并与连接辣根过氧化酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后者又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞，因而在光学显微镜下即可观察凋亡细胞；由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3‘-OH形成，很少能够被染色。本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。还可应用于抗肿瘤药的药效评价，以及通过双色法确定细胞死亡类型和分化阶段。
二、 器材与试剂
器材：光学显微镜及其成像系统、小型染色缸、湿盒（塑料饭盒与纱布）、塑料盖玻片或封口膜、吸管、各种规格的加样器及枪头等；
试剂：试剂盒含：
1号（蓝盖）Enzyme Solution 酶溶液：TdT 10×、
2号（紫盖）Label Solution标记液：荧光素标记的dUTP 1×、
3号（棕瓶）Converter-POD:标记荧光素抗体的HRP；
自备试剂：PBS、双蒸水、二甲苯、梯度乙醇（100、95、90、80、70%）、
DAB工作液（临用前配制，5 μl 20×DAB+1μL 30%H2O2+94 μl PBS）、
Proteinase K工作液（10-20 μg/ml in 10 mM Tris/HCl，pH -8）或细胞通透液（% Triton X-100 % 柠檬酸钠，临用前配制）、
苏木素或甲基绿、DNase 1（3000 U/ml– 3 U/ml in 50 mM Tris-HCl，pH ， 10 mM MgCl2，1 mg/ml BSA）等。
三、 实验步骤
操作流程图：制作石蜡切片→脱蜡、水合→细胞通透→加TUNEL反应液→加converter-POD→与底物DAB反应显色→光学显微镜计数并拍照。
具体操作步骤（石蜡包埋切片的检测）：
1. 用二甲苯浸洗2次，每次5min；
2. 用梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次，每次3min；
注：上面两步是针对石蜡切片样本的处理
9. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm）；
10. 玻片干后加50μl 3号液（converter-POD）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
11. PBS漂洗3次；
12. 在组织处加50~100μl DAB底物，反应15~25℃×10min；
13. PBS漂洗3次；
14. 拍照后再用苏