基因工程实验流程总览.ppt

基因工程实验流程总览
DNA提取,纯化
限制图谱
琼脂糖电泳检测片段
体外扩增PCR
目的基因制备
载体选择
DNA重组片段连接
未知核酸序列须
DNA片段大小估计
互补性黏性
不互补性黏性末端
平末端
限制性核酸内切酶酶切分离法简单基因组分离如质粒和病毒
物理化学法
构建基因组文库
PCR扩增
基因的化学合成
双抗体免疫法
酶促反应mRNA-cDNA
目的基因分离
双酶切
部分酶切
Bal31逐步切割
转座子
基因定位克隆
酵母双杂交
前处理防止自连
RNA提取
RT-PCR
TA克隆
蓝白选择
胶回收
表达引物PCR
载体
PCR产物回收
转化感受态细胞
构建基因组文库
真核生物有成千上万个碱基对,单个未知基因在整个基因组中的比例很小且不能在体外特异性扩增,所以只能对所有基因扩增,也就是构建基因组文库。
油菜TOC33基因片的克隆
实验项目背景
国家自然科学基金项目(油菜叶绿体蛋白质转运突变体中差异表达基因的克隆,编号:30170500)。
实验目的
通过本综合实验,掌握植物基因组DNA的制备技术、PCR技术、限制性内切酶酶切技术、重组DNA技术、克隆鉴定技术、质粒DNA的制备、琼脂糖凝胶电泳技术、测序技术、生物信息技术等,得到一个与科学研究过程相近的分子生物学综合技能训练。
具体实验步骤
Ⅰ.植物基因组DNA的制备
Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
Ⅲ. DNA的琼脂糖凝胶上回收与纯化
IV. DNA片段的体外重组与转化
V. 克隆的筛选与鉴定

Ⅰ.植物基因组DNA的制备
EP管中,放在液氮中冷冻处理后,在EP管中充分捣碎, 抽提缓冲液,65℃水浴处理10min。
12,000rpm离心3min,取上清,加入二倍体积预冷的无水乙醇沉淀,遇有絮状沉淀,4,000rpm离心5min。
沉淀用50ul TE-RNase( ,,RNase A 30ug/mL)溶解,37℃保温处理15min。
加入二倍体积预冷的无水乙醇,-20℃下沉淀10min ,4,000rpm离心3min,加适量70%乙醇洗沉淀,自然干燥或37℃烘干,加入50ul ddH2O溶解备用。
Ⅱ.TOC33基因片段的PCR扩增
引物设计,为扩增Toc33片段,用OLIG05. 0设计1对PCR引物:
上游引物P1: 5'一ATGGGGTCTCTCGTTCGTGAAT-3',
下游引物P2:5'ACTTGTC一3'。
在管内配制25ul反应体系:
10×PCR Buffer ul
Mg2+ ul
dNTP ul
Primer 1 ul
Primer 2 ul
Taq 酶 ul
模板 ul
ddH2O ul
1)       94 oC 预变性 5 min
2)       94 oC变性 30 sec
3)       55 oC退火 30 sec
4)       72 oC延伸 45 sec
5)       重复步骤2)-4)30次
6)       72 oC延伸10 min
琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
1) 称取琼脂糖放入溶胶瓶中,再加入1ml 50×TAE缓冲液,49ml 高水,置微波炉或水浴加热至完全融化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。
2)   取电泳槽里面的胶板,用胶带将两端封好,调平,并放好样品梳子。
3) 将冷到60oC左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入胶板,直至胶板上形成一层均匀的胶面。
4) 待胶凝固后,取出梳子,放在电泳槽内。电泳槽内应加入电泳缓冲液。
5)  用移液枪将已加入上样缓冲液的PCR产物加入加样孔。
6) 接通电泳槽和电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动);选择合适的电压,开始电泳;
7)  当溴酚蓝燃料移动倒距离凝胶前言1-2cm处,停止电泳。
8) 将电泳的凝胶浸入溴化乙锭染色液中,染色10min后取出,用清水冲洗。将胶放于凝胶成像系统内拍照,以观察样品在琼脂糖凝胶中的带(EB有剧毒,戴手套操作)。
电泳染色后,在紫外分析仪上切取所需要的条带,按1克胶:1000添加提取缓冲液,放在60度的金属浴中溶解。然后把溶液转移到试剂盒专用管中,6000转/分离心1分钟;
倒掉上清,再加入500微升的extraction buffer,12000r/min离心1分钟;
倒掉上清,加入750微升的wash buffer ,12000r/min离心1分钟;
倒掉上清,重复步骤三;
倒掉上清,在12000r/min下空转1分钟;
把带有膜的管子换到新的EP管中,加入30~50微升的水,静置1分钟