实验四--肌肉组织氨基移换作用---纸层析.ppt

一、实验目的
1. 了解氨基移换作用的原理。
2. 熟悉纸层析法的基本原理。
3. 掌握纸层析法分离鉴定氨基酸的方法。
第一页，共12页。
氨基移换作用（转氨基作用）
在转氨酶的作用下，某一氨基酸去掉α-氨基生成相应的α-酮酸，而另一种α-酮酸得到此氨基生成相应的氨基酸的过程。
二、实验原理
第二页，共12页。
人体内最重要的两种转氨酶：
谷丙转氨酶（GPT）/丙氨酸转氨酶（ALT）
谷草转氨酶（GOT）/天冬氨酸转氨酶（AST）
谷氨酸 +丙酮酸
α-酮戊二酸 +丙氨酸
GPT
谷氨酸 +草酰乙酸
α-酮戊二酸 +天冬氨酸
GOT
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正常人各组织中GPT及GOT 活性 (单位/克湿组织)
血清转氨酶活性，临床上可作为疾病诊断和预后的指标之一。
组 织 GPT GOT
组 织 GPT GOT
肝 44000 142000
胰 腺 2000 28000
肾 19000 91000
脾 1200 14000
心 7100 156000
肺 700 10000
骨骼肌 4800 99000
血清 16 20
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谷氨酸 丙酮酸
α-酮戊二酸 丙氨酸
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2. 层析
层析系统通常都有两个相组成：固定相和流动相。
混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。
常用的分配层析包括柱层析、纸层析、薄层层析。
第六页，共12页。
纸层析法
固定相：吸附在滤纸纤维之间的水分
流动相：层析液水饱和酚
分离原理：
利用混合物各组分在固定相和流动相中分配系数
差异而分离
谷氨酸：亲水性氨基酸
丙氨酸：疏水性氨基酸
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3. 显色反应
茚三酮与α-氨基酸反应生成紫红色化合物
相对迁移率Rf
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三、实验步骤
1、酶液的制备
2、氨基移换反应
加入物（ml）
对照管
测定管
肌匀浆
10滴
10滴
煮沸 5 min
37 ℃ 5 min
mol/L丙氨酸溶液
ml
ml
mol/Lα-酮戊二酸溶液
ml
ml
mol/L 磷酸盐缓冲液
ml
ml
混匀， 37 ℃ 50 min
煮沸5 min
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3、层析
圆滤纸上标记
点样
制作滤纸芯
滤纸芯插入圆滤纸
组装层析装置
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