孔雀石绿ELISA讲义资料.ppt

隐形孔雀石绿多克隆抗体的制备及鉴定
汇 报 人：
导 师：
汇报时间：
摘自 《食品科学》
01
OPTIONS
02
OPTIONS成的隐性孔雀石绿衍生物用碳化二亚胺法合成免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA。
具体步骤如下：
称取8mg %二甲基亚砜的MES缓冲液()中， N-羟基琥珀酰亚胺。
混合物室温搅拌30min，逐滴加入50mL 1mg/mL BSA溶液中。混合物室温搅拌2h， PBS ()透析，去掉未反应物，即制备出隐性孔雀石绿-BSA全抗原。
BSA：牛血清蛋白
碳二亚胺：主要用于活化羧基，使羟基和氨基间脱水形成酰胺键。
PBS：磷酸盐缓冲液，与人体血液等渗，主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。
N-羟基琥珀酰亚胺：用于在酰胺键形成时活化羰基基团，减少副产物。
实验方法
实验步骤三 抗隐性孔雀石绿多克隆抗体的制备
应用免疫抗原隐性孔雀石绿-BSA，采用常规免疫程序免疫新西兰大白兔，制备多克隆抗体。
空白组
背部皮下注射甲试剂 1ml/只
两周后，背部皮下注射乙试剂 1ml/只
两周后，同上
1周后采血制备抗血清，用免疫沉淀实验检测抗体效价。并加强免疫，每次用量均为1mL ，且不加任何佐剂，隔周注射，直到抗体效价不再升高为止。
甲试剂：将制备的完全抗原与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化，。
乙试剂：换做弗氏不完全佐剂乳化，其他处理同甲。
获取抗体时，采用颈动脉插管取血，血样先27℃放置1h，然后置于37℃ 2h，最后4℃过夜。肉眼观察血块收缩后，轻轻吸取血清。
血清用硫酸铵沉淀法进行纯化。 PBS溶液混匀，于冰上拌并缓慢逐滴加入4mL饱和硫酸铵(预冷)。置4℃条件下3h，使其充分沉淀(或于4℃冰箱中静置过夜)。
6000r/min离心10min，弃上清液。用PBS溶解该沉淀至5mL，(:1)，置0℃条件下3h。6000r/min离心10min，弃上清液。用PBS溶解该沉淀至5mL。 (:1)，置0℃条件下3h。
6000r/min离心10min，弃上清液。 PBS- NaN3()溶解至5mL。装入透析袋透析(室温即可)，以彻底除去硫酸铵。
纯化结束后，，，置－70℃低温保存。
获取抗体及血清纯化的具体步骤
实验方法
实验步骤四 隐性孔雀石绿特异性抗体的鉴定和效价测定
用碳二亚胺法合成包被抗原LMG-OVA(合成方法同前)，建立ELISA方法检测LMG抗体灵敏度。
具体步骤如下：用包被液()系列稀释包被抗原LMG-OVA(1: 500、
1: 1000、1: 2000、1: 4000、1: 8000、1: 16000、1: 32000、1: 64000)，每孔100μL包被酶标板并4℃过夜。PBST洗涤，每孔加180μL封闭液(1%酪蛋白，%吐温-20， PBS)，室温2h。洗涤，每孔加100μL系列稀释(1: 5000、1: 10000、1: 20000、1: 40000、1: 80000、1: 120000)的抗血清，37℃。设重复孔及阴性对照孔。洗涤，每孔加入100μL HRP-羊抗兔抗体(1:2000稀释)，于37℃。洗涤，每孔加入底物液A(TMB)和底物液B(30% H2O2)各50μL，37℃条件下10～15min。最后每孔加入50μL终止液终止反应5min，读取492nm波长处的吸光度A492nm。
OVA为卵清蛋白。
采用ELISA法鉴定抗体效价时，需偶联不同于免疫原的载体蛋白作为包被抗原。
实验结果及分析
结果一 隐性孔雀石绿衍生物的合成结果
实验结果及分析
结果二 隐性孔雀石绿-BSA全抗原的制备结果
实验结果及分析
结果三 隐性孔雀石绿特异性抗体效价测定
实验结果及分析
结果三 隐性孔雀石绿特异性抗体效价测定
半抑制浓度（或称半抑制率），即IC50。