植物激素的测定方法讲义教材.ppt

植物激素的酶连免疫分析法
操 作 步 骤
包被---温育---洗涤---竞争---温育---洗涤---加二抗---温育---洗涤---显色---比色---计算
包 被
每小孔中加入100
植物激素的酶连免疫分析法
操 作 步 骤
包被---温育---洗涤---竞争---温育---洗涤---加二抗---温育---洗涤---显色---比色---计算
包 被
每小孔中加入100μl包被缓冲液，然后将酶标板放入内铺湿纱布的带盖瓷盘内。
37 ℃。
洗 板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。
竞 争
即加标准物、待测样和抗体。
加标样及待测样： 取适量所给标样稀释配成： ABA标准曲线的最大浓度为100ng/ml,然后再依次2倍稀释8个浓度（包括2个0ng/ml，加入前两行的最后两排 ）。将系列标准样加入96孔酶标板的1、2、3行，每个浓度加3孔，每孔50μl,其余孔加待测样，每个样品重复3孔，每孔50μl。
加 抗 体
在微孔中加入一定量的抗体,混匀后每孔加50μl，然后将酶标板加入湿盒内开始竞争。
竞争条件37℃。
洗 板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。
加“二抗”
将适当的酶标二抗，加入10ml样品稀释液中（比如稀释倍数1:1000就加10μl），混匀后，在酶标板每孔加100μl，然后将其放入湿盒内，置37℃下，。
洗 板
将反应液甩干并在报纸上拍净。第一次加入洗涤液后要立即甩掉。然后再接着加第2次。共洗涤3次。
加底物显色
在每孔中加100μl 邻苯二胺（OPD）溶液（小心勿用手接触OPD），（每10ml溶液中含4μl 30% H202。混匀，然后放入湿盒内，当显色适当后（肉眼能看出标准曲线有颜色梯度，且100ng/ml孔颜色还较浅），每孔加入50μl 2mol/L硫酸终止反应。
比 色
在酶联免疫分光光度计上依次测定标准物各浓度和各样品490nm处的OD值。
用酶标仪进行比色，以0 ng/ml标准孔为空白孔，在波长450nm处分别读取各标准孔和样本孔OD值，以OD值为横坐标，“标样激素含量的对数”为纵坐标，在半对数坐标纸上画出标准曲线，以测定孔的OD值在标准曲线上查出待测样品的ABA含量的对数。利用反对数求得ABA的绝对含量。
数 据 分 析
植物激素的测定方法？
生物活性法
气相色谱（气-质联机）
液相色谱（液-质联机）
酶连免疫法（ ELISA 法）
问题：我们该选择哪种板呢？
ELISA技术的特点与局限性
（1）ELISA特点：在固相表面组装免疫活性物质形成"免疫吸附剂"；酶标记免疫活性物质，进行信号放大；有二步温育反应二次洗涤过程；灵敏度特异性相对较高。
（2）ELISA局限性：只能检测到ng水平，精密度差（批内CV15-20%）；线性范围窄（一个数量级）。
注意事项 ：
（1）微量加液器应注意保养并定期校正，否则结果误差较大，同时加样时不可出现气泡，以免反应物间不能充分混匀反应。
（2）洗涤时力求次数足够，且避免形成气泡，否则洗涤不完全。
（3）温育时要力求受热均匀，同时避免液体蒸发。
（4）比色时反应管内不能留有气泡，管底不能存有水滴，否则出现较大误差。
酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)
原理（以间接性ELISA为例）：
显色
抗 原
医学上重要的抗原
伤寒杆菌
链球菌
痢疾杆菌
流感病毒
口蹄疫病毒
狂犬病病毒
抗原的概述
抗原（Ag）是指能与淋巴细胞抗原受体特异性结合，刺激机体免疫系统产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物在体内、外发生特异性反应的物质
抗原的两个基本特性
免疫原性（immunogenicity)
免疫反应性 (immunoreactivity)
完全抗原
(complete antigen)
半抗原(hapten)
载体(carrier)
半抗原
+
载体
抗体
B
T
完全抗原
B
B
B
T
抗体（Ab）