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遗传毒性评价
第1页，本讲稿共24页
一、实验目的
了解微核检测的原理和毒理遗传学意义。
掌握蚕豆根尖微核（或细胞电泳）监测环境污染的一般方法。
3. 学会利用微核测试系统评价环境物质的遗传毒理效应。
第2页，本讲稿共尖微核测试系统，并首次用于监测水环境污染，经鉴定已列入国家《生物监测技术规范（水环境部分）》。美国国家环保局也肯定了蚕豆根尖微核试验在环境突变性检测中的作用，对许多环境致癌物都作了标准化的试验，建立了庞大的数据库，可以推广。
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三、实验用具
1、材料：蚕豆（Vicia faba, 2n=12）干种子
蚕豆根尖细胞的染色体大、数量少，DNA含量高，根尖中含有较多的分裂相细胞，对诱变因子反应敏感，且容易观察，是理想的遗传毒理分析材料。
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显微镜、培养箱、紫外灯、水浴锅、剪刀（或刀片）、镊子、解剖针、载玻片、盖玻片、烧杯、滤纸等。
2、实验仪器及用具
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1mol/L盐酸、甲醇、冰醋酸、改良苯酚品红染液；
NaN3（叠氮钠）、EMS（甲基磺酸乙酯）、DES（硫酸二乙酯）等化学诱变剂等；
紫外线、微波等物理诱变因子。
3、药品和试剂
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1、浸种催芽：25℃下浸泡24h，吸胀后，用河沙作发芽床，25℃培养箱中催芽12～24h，初生根长出2～3mm时，取发芽良好的种子，放入铺满滤纸的瓷盘中，25℃继续催芽，大部分根长至1～2cm （约36~48h） 。
2、染毒：用被检测液处理根尖。每处理选6～8粒初生根生长良好、根长一致的种子，放入培养皿中，用被检测液浸没根尖。阳性因子可采用NaN3和紫外线等，、 、 NaN3溶液。紫外线分别处理20、40、60min。另外可取一处污水作被检液之一。用自来水（或蒸馏水）处理作对照。处理根尖12～24h。
3、根尖细胞恢复培养：处理后的种子用自来水（或蒸馏水）浸洗三次，每次2～3min。洗净后置入辅有湿润滤纸的瓷盘中，25℃下恢复培养22～24h。
四、实验操作流程
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4、根尖细胞固定并保存：切取恢复后的1cm长的幼根，甲醇：冰醋酸（3：1）液固定24h。 置70%的乙醇中保存于4℃冰箱中。
5、解离：加入1mol/L盐酸浸没幼根10min，使幼根软化。解离前后用蒸馏水清洗干净。
6、染色、压片：截取1～2mm长的根尖置载玻片上，滴一滴染液，染色5～8min，加上盖玻片，压片。
7、镜检观察、计数：首先在低倍镜下找到分生组织区细胞分散均匀，分裂相较多的部位，再转高倍镜观察。
每一处理观察3个根尖，每个根尖数1000个细胞，统计其中含微核的细胞数，然后平均，即为该处理的MCN‰ ，即微核千分率。
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五、结果与分析
微核识别标准：
（1）在主核大小的1/3以下，并与主核分离的小核。
直径大约是细胞直径的1/20～1/5。
（2）小核着色与主核相当或稍浅。（3）小核形态为圆形、椭圆形或不规则形。
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处理
观察的细胞数
微核数
总计
微核‰
NaN3 (mmol/L)



紫外线(min)
20
40
60
蚕豆根尖微核检测记录表
注：以小组为单位统计平均微核千分率。
处理
观察的细胞数
微核数
总计
微核‰
NaN3 (mmol/L)



蒸馏水
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计算各测试样品（包括对照）的微核千分率（MCN‰）：

样品污染（中毒）程度的确定：
MCN‰﹤10‰，基本没有污染（中毒） ；10‰MCN‰18‰，轻度污染（中毒） ；18‰﹤MCN‰﹤30‰，中度污染（中毒）；MCN‰﹥30‰，重度污染（中毒）。
某样品或对照观察到的微核数
某样品或对照观察到的细胞数
MCN‰=
×1000‰
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“污染指数”判别（此方法可避免因实验条件等因素带来的MCN‰本底的波动）：
             样品实测微核平均千分率
对照平均微核千分率
0﹤PI﹤，基本没有污染；
﹤PI﹤2，轻度污染；
2﹤PI﹤，中度污染；
PI﹥，重度污染。
污染指数PI=
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MN
NCE