葡聚糖凝胶G-25的使用方法(共5页).doc

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葡聚糖凝胶柱的使用方法：
(1) 糖—2000溶液：称取蓝色葡聚糖—2000 10毫克，溶于2毫升Tris—醋酸缓冲液()中即成。
(4) 样品溶液：，蓝色葡聚糖—。
(5)葡聚糖凝胶G-25 (Sephadex-G-25)
【实验操作】
：商品凝胶是干燥的颗粒，使用时需经溶胀处理，称取4克葡聚糖凝胶G—25，加50毫升蒸馏水，搅拌均匀，在室温溶胀6小时，或沸水浴溶胀 2小时，一般采用后一种方法。再用倾泻法除去凝胶上层水及细小颗粒，用蒸馏水反复洗涤几次，再以缓冲溶液(—醋酸溶液)洗涤2—3次，使pH和离子强度达到平衡，最后抽去溶液及凝胶颗粒内部气泡，凝胶可保存在缓冲液内。
：将层析柱洗净，垂直固定在铁支架上，选择有薄膜端作为层析柱下口，将下口接上乳胶管并用螺旋夹夹紧。层析柱中加入洗脱液，打开下口螺旋夹，让溶液流出，排除残留气泡，最后保留约
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2厘米高度的洗脱液，拧紧螺旋夹。将凝胶轻轻搅动均匀，用玻璃棒沿层析柱内壁缓缓注入柱中，待凝胶沉积到柱床下已超过l厘米时，打开下口螺旋夹，继续装柱至柱床高度达到8厘米,关闭出口。装柱过程中严禁产生气泡，尽可能一次装完，避免出现分层。再用洗脱液平衡l至2个柱床体积，凝胶面上始终保持有一定的洗脱液。平衡后，拧紧下端螺旋夹。
：打开螺旋夹使柱面上的洗脱液流出，直至床面与液面刚好平齐为止，关闭下端出口。取溴酚蓝及蓝色葡聚糖—，小心地加于凝胶表面上，切勿搅动层析柱床表面。打开下端出口，使样品溶液进入凝胶内，并开始收集流出液。当样品溶液恰好流至与凝胶表面平齐时，关闭下端出口。用少量洗脱液清洗层析柱加样区，共洗涤三次，每次清洗液应完全进入凝胶柱内后，再进行下一次洗涤。最后在凝胶表面上加入洗脱液，保持高度为3—4cm。
：连接好凝胶柱层析系统，调节洗脱液流速为每分钟1毫升，进行洗脱。仔细观察样品在层析柱内的分离现象，收集洗脱液，每收集3毫升即换一支收集管(试管预先编号)，收集约20管左右，样品即可完全被洗脱下来。将各收集管中的洗脱液分别用721型分光光度计在波长540nm处测定其光密度。
：将样品完全洗脱下来后，继续用三倍柱床体积的洗脱液冲洗凝胶后，将柱下口放在小烧杯中，慢慢打开，再将上口慢慢松开，使凝胶全部回收至小烧杯中，备用。
 2 Sephadex LH20 的原理。
Sephadex LH20的分离原理主要有两方面：以凝胶过滤作用为主，兼具反相分配的作用（在反相溶剂中）。因为凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。如果使用反