基因工程基本流程获取目的基因课件.ppt

关于基因工程基本流程获取目的基因
现在学习的是第一页，共67页
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获取目的基因
目的基因修饰、改良
建立高效表达系统
表达调控机制研究
现在学习的是第二页，共67页
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鸟枪法
cDNA法
PCR扩增
5’
3’
现在学习的是第十九页，共67页
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现在学习的是第二十页，共67页
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2）cDNA第二链合成-置换合成
RNaseH
识别mRNA-cDNA杂交分子中的mRNA，并将其降解成许多小片断
小片断正好成为DNA聚合酶的引物，用来合成冈崎片断
DNA Pol I除去引物并修补后再使用DNA连接酶连成一整条DNA链
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mRNA
cDNA
3’
5’
反转录酶
引物
mRNA
cDNA第一链
3’
5’
引物
mRNA
cDNA第一链
3’
5’
mRNA
mRNA
DNA
聚合酶
DNA
聚合酶
cDNA第二链
cDNA第一链
3’
5’
RNaseH
DNA ligase
去引物
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现在学习的是第二十三页，共67页
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第一链合成完毕后，变性去除残留的mRNA，在cDNA的游离3’末端添加Oligo dC，然后与人工合成的Oligo dG退火，形成引物结构，聚合第二条链。
3）cDNA第二链合成-引物合成
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mRNA
3’
5’
AAAAAAA
cDNA第一链
5’
TTTTTTTT
3’
碱处理
cDNA第一链
5’
TTTTTTTT
3’
dCTP
末端转移酶
cDNA第一链
5’
TTTTTTTT
3’
CCCCCCC
加入Oligo dG退火
cDNA第一链
5’
TTTTTTTT
3’
CCCCCCC
GGGGGGG
5’
3’
聚合酶
cDNA第二链
cDNA第一链
5’
TTTTTTTT
3’
CCCCCCC
GGGGGGG
5’
3’
AAAAAAA
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双链cDNA的克隆
克隆方案的选择标准与鸟枪法相同
末端性质
筛选方案
片段大小
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cDNA重组克隆的筛选
原位杂交
产物功能检测
差示法（差别杂交/扣除杂交）
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在一个细胞群体中目的基因正常表达，在另一个细胞群体中目的基因不表达。在这种情况下便可制备到两种不同mRNA提取物。其一是含有一定比例的目的基因mRNA种的总mRNA群体，其二是不含有目的基因mRNA种的总mRNA群体。通过这两种总mRNA（或是它们的cDNA拷贝）为探针的平行杂交，对由表达目的的基因的细胞总mRNA构建的克隆库进行筛选。当使用存在目的基因的mRNA探针时，所有包含着重组体的菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点；而使用不存在目的基因的mRNA探针时，除了含有目的基因的菌落外，其余的所有菌落都呈阳性反应，在X光底片上呈现黑色斑点。比较这两种底片并对照原平板，便可以挑选出含目的基因的菌落。
差别杂交
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现在学习的是第二十九页，共67页
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局限性
差别杂交的灵敏度比较低，特别是对于那些低丰度的mRNA而言，这个缺点就显得更加突出
差别杂交需要筛选大量的杂交滤膜，鉴定大量的噬菌斑或克隆片段，十分耗费时间和金钱
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原理：
羟基磷灰石柱
结合DNA-RNA或DNA-DNA双链，不结合单链DNA。
（Hydroxylapatite column）
扣除杂交
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从表达A蛋白和不表达A蛋白的组织细胞中分别提取和分离总mRNA。
将表达A蛋白的mRNA合成cDNA第一链。再同不表达A蛋白的总mRNA杂交成cDNA-mRNA双链。
不能杂交的cDNA就包括特异表达的A基因的cDNA单链。
用羟磷灰石柱收集单链cDNA，合成为双链DNA进行扩增、克隆、测序。
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A
A
A组织
B组织
总mRNA（A）
总mRNA（B）
含蛋白A的mRNA
不含蛋白A的mRNA
总cDNA第一链
A
杂交
内含蛋白A 的cDNA
羟磷灰石柱
过柱
吸收RNA-DNA
单链滤过
羟磷灰石柱
B
A
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PCR扩增法