基因工程操作流程.ppt

基因工程操作流程
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为什么RNA聚合酶能够仅在启动子处结合呢?
启动子处的核苷酸顺序具有特异的形状以便与RNA聚合酶结合，就好像酶与其底物的结构相恰恰适合一样。将100个以上启动子的A
目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。
1. 目的基因的获取
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基因文库的种类：
基因组文库：含有一种生物所有的基因
部分基因文库：含有一种生物的一部分基因（如：cDNA文库）
获取目的基因的方法一：从基因文库中获取目的基因
基因文库（gene library）的概念：
将含有某种生物的不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。
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组织或细胞染色体DNA
限制性核酸内切酶
DNA片段
重组DNA分子
含重组分子的转化菌
载体
受体菌
基因组文库
存在于转化细菌内，由载体所携带的所有基因组DNA的集合。
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mRNA
逆转录酶
c DNA
双链cDNA
重组DNA分子
载体
含重组分子的转化菌
受体菌
用某种生物发育的某个时期的mRNA制备双链的cDNA后，建立的基因文库。
cDNA文库
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文库类型
cDNA文库
基因组文库
文库大小
小
大
基因中启动子（具有启动作用的DNA片段）
无
有
基因中内含子（位于编码蛋白质序列内的非编码DNA片段）
无
有
基因多少
某种生物的部分基因
某种生物的全部基因
物种间的基因交流
可以
部分基因可以
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PCR(polymerase chain reaction)
——多聚酶链式反应
是一项在生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。
获取目的基因方法二：利用PCR技术扩增目的基因
PCR扩增仪
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原理：DNA双链复制
反应过程：
1. 变性：将反应系统加热至90 ℃ -95℃ ，使模板DNA完全变性成为单链；
2. 退火：将温度下降至55℃- 60℃左右，使引物与模板DNA退火结合；
3. 延伸：将温度升至70℃- 75℃ ，DNA聚合酶 以dNTP为底物催化DNA的合成反应。
上述三个步骤为一个循环，经25～30次循
环后，可将模板DNA扩增达百万倍。
反应体系：模板DNA、特异性引物、
耐热DNA聚合酶、dNTP及缓冲液
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利用PCR技术扩增目的基因
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DNA合成仪
过程：
适用范围：
已知核苷酸序列，基因的核苷酸数量较少。
蛋白质的氨基酸序列
mRNA的核苷酸序列
结构基因的核苷酸序列
推测
推测
目的基因
化学合成
获取目的基因方法三：化学合成法
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小结:
目的基因的获取：三种方法
(1)从基因文库中获取
适用于目的基因序列为未知的情况
(2)利用PCR技术扩增
适用于目的基因的序列为已知的情况
(3)人工合成
适用于目的基因不是很大且其序列是已知的
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基因表达载体的组成
目的基因
启动子
终止子
标记基因等
标记基因：鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
2、基因表达载体的构建
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常用的受体细胞
动物、植物、微生物
转化：
目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。
3、目的基因导入受体细胞
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1）将目的基因导入植物细胞
农杆菌转化法
基因枪法
花粉管通道法
转化方法
2）将目的基因导入动物细胞
显微注射技术
3）将目的基因导入微生物细胞
常用CaCl2
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1）将目的基因导入植物细胞
常用方法：---农杆菌转化法

适用范围：
双子叶植物和裸子植物
转化过程：
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1）将目的基因导入植物细胞
——基因枪法
基因枪法又称微弹轰击法，是籍高速度运动的金属微粒将附着于其表面的核酸分