实验六质粒提取及琼脂糖凝胶电泳.ppt

实验六质粒提取及琼脂糖凝胶电泳
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DNA重组：指不同来源的DNA片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息的新的重组体DNA。
DNA体外重组技术：是在分子水平上，根据人们的需要以有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、 α-互补显色反应（蓝白斑筛选）
表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件
生物安全性好
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载体种类：
质粒
噬菌体载体
酵母人工染色体（YAC）
病毒载体
常用的克隆载体
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质粒
：质粒是独立存在于细菌染色体外的，能独立复制的环状双链DNA分子。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性Ampr等。
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2．来源
存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。
3．分类
质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒
①严紧型质粒(Stringent control)
严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制时,它也不能复制,通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒,如 F 因子。
②松弛型质粒(Relaxed control)
松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许多拷贝,一般在 20 个以上,如 Col质粒。
松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。
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（1）. 超螺旋DNA （supercoiled DNA, sc DNA）
超螺旋
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（2）.开环DNA (open circle DNA, oc DNA)
开环DNA
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（3）.线形DNA（linear circle DNA，lc DNA)
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与本实验有关的两种质粒
(作为目的基因供体)
4363bp
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(作为载体）
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实验 质粒DNA提取
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实验目的
。
。
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碱裂解法提取质粒原理
碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的分子大小和结构不同利用二者之间变性和复性的差异来实现分离的。
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强碱及机械剪切力
①染色体DNA断裂成小片段线性DNA（机械剪切力)
②染色体氢键断裂，双链解离变性（强碱）；
①质粒DNA保持闭合环状；
②双链DNA并未完全分离（强碱）。
酸中和至中性
变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物
质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中
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琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理
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带电颗粒在电场中泳动的速度
由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力(f·υ)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度(υ)向前泳动
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式中f为摩擦系数。根据Stoke公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即
式中 f——阻力，牛顿；
r——粒子半径，米；
η ——介质粘度，牛顿·秒/米2；
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从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电场强度和带电颗粒的净电荷量成正比，而与颗粒半径和介质黏度成反比
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电泳迁移率
电泳迁移率（mobility）:在电位强度E的影响下，带电颗粒在时间t中的迁移距离d。
d 为带电颗粒泳动的距离(cm)；
l 为支持物的有效长度(cm)；
t为通电时间(秒)；
V为加在支持物两端的实际电压(V)
单位是cm2·sec-1 ·V-1
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实验步骤
，12000rpm×30S
重复一次，最后一次