构建桑树遗传图谱群体的亲本单株遗传图谱检测.doc

构建桑树遗传图谱群体的亲本单株遗传图谱检测
Mulberry Genetic Map Construction Group of Parent Plant Genetic Map
生命与环境科学学院 2016级植物学专业 碱基序列， 紧跟着 CCGG( 上游引物) 或AATT( 下游引物) 的碱基序列， 第三个序列框是位于3'端的3 个选择性碱基。引物3'端的3 个选择性碱基可以选择模板 DNA。而上游引物的 CCGG 序列可以首先与外显子序列（富含 GC 碱基）退火结合， 而下游引物的 AATT 序列可优先与内含子和启动子序列（富含 AT 碱基）退火结合③。不同的个体及物种的内含子、启动子与间隔区长度不同因而产生多态性。由于具有独特的引物设计，因此SRAP 标记具有更好的重复性、 简易型和稳定性。SRAP标记已成功地应用于作物遗传多样性分析、遗传图谱构建、重要性状标记以及相关基因克隆等方面。已应用于芸苔属( Brassica) ③、野牛草( Buchloe dactyloides) ④、黑麦草( Lolium) ⑤南瓜属( Cucurbita) ⑥、紫花苜蓿( Medicago sativa) ⑦和芍药属( Paeonia) ⑧。同时实验证明在研究某些品种间的遗传多样性时 SRAP标记比 SSR( simple sequence repeats， 简单重复序列) 、RAPD标记和ISSR( inter- simple sequence repeat， 简单序列重复区间扩增多态性)更加有效。
材料与方法
实验材料

该实验材料由山东省烟台市蚕业研究所提供，选取5株父本，5株母本，将父本母本进行人工杂交后，共得到81株子代，将81株子一代的DNA直接进行电泳，选取其中7株DNA提取较好的子一代。


pcr扩增仪：L96G 杭州朗基科学仪器制造公司
海尔冰箱：（4℃，-20摄氏度）海尔bcd-539wf型，中国海尔集团
BIO-RAD凝胶成像仪：
移液枪：2μl 10μl 100μl 法：BS-224S型，背景奥多利斯仪器系统有限公司
DNA的提取
实验所用DNA是由CTAB法进行提取。该方法是由Murray和Thompson（1980）修改而成的简便方法。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（ NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度（ NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖类物质分开。
SRAP标记检测
首先利用一个DNA对25对引物进行筛选，对带型较为清晰且有稳定多态的8对引物进行正式扩增。PCR反应体系总体积为20μL，其中6μLDNA样品，， Taq聚合酶，10×PCR buffer2μL， Mg²+，，用纯水补充至20μL。
PCR扩增程序：Ⅰ94 ℃预变性5 min;
Ⅱ94 ℃变性1min， 35 ℃ 退火1min，72 ℃延伸90 s， 5个循环;
Ⅲ94 ℃变性1min，50℃ 退火1min，