淮安取样流程.doc

淮安食管癌高发现场工作方案
研究目的
明确淮安食管癌高发区食管癌的主要环境危险因素
建立高发区食管癌的遗传易感基因模式
淮安食管癌的发病风险评价
研究内容
收集食管癌标本，开展1:1配对病例对照研究的问卷调查
相关代谢酶和修复收集食管癌新发病例→按配对条件匹配对照→问卷调查→采集组织和肝素抗凝全血5ml→提取RNA、DNA和总蛋白→进行等我基因多态、mRNA表达和蛋白的Western blotting分析→结合环境危险因素和肿瘤家族史，应用SAS统计软件分析环境及遗传易感性在淮安地区食管癌发病中的作用
按配对条件匹配对照
收集食管癌新发病例
问卷调查
外周血5ml
癌组织和癌旁组织各2块
RNA提取
蛋白提取
DNA提取
环境危险因素分析
基因表达分析
基因序列变异分析
基因功能分析
食管癌相关biomarks
提出淮安地区食管癌一级和二级预防策略
需淮安现场配合适宜：
收集病例及对照：按照研究对象入选条件选择病例及对照，问卷调查尽量填写完整准确，按10%的复查率进行质量控制。
样品采集：收集肿瘤患者新鲜手术组织，包括癌组织和远端癌旁组织个2块，分别立即投入RNAstore储存液，-20℃保存；并取同一对象的肝素抗凝全血5ml，对照仅采集新鲜肝素抗凝全血5ml，采后充分混匀；淋巴细胞分离前血样可储存于4℃，保存时间以6小时内为宜，超过2小时血样难易保证RNA提取质量；严禁冻存！
试验仪器：水平（低速）离心机<可放置10ml玻璃试管>；冷藏箱（4℃）及冷冻箱（-20℃）；托盘天平。
样本处理流程：
-20℃保存
加入Trizol
环境危险因素分析
分离PBMC
分离血浆
分别投入RNAstore液中
食管癌新发手术病例，编号
匹配对照，编号
采集外周血5ml
取癌组织和癌旁组织
问卷调查
试验设备：
高速低温离心机
实时荧光定量PCR仪
平干式电转仪
RNA、DNA浓度测定仪
七．经费预算：
1. 购买试剂：2万元
2. 现场花费：2万元
附件：
淮安现场实验方法
实验试剂及仪器
实验试剂：（4℃保存）
淋巴细胞分离液（避光）：用前应在室温平衡30min。
Trizol（避光）：应在洁净环境中使用，注意防止唾液、汗液、灰尘等的污染。
PBS：用前应在室温下平衡30min。
RNAstore储存液：4℃保存，用前应检查有无沉淀，如有应在37℃下水浴溶解后再进行使用，否则难以保证样本的储存效果。
实验仪器
水平（低速）离心机
冰箱：4℃及-20℃冰箱
工作内容
收集病例及匹配对照并进行流行病学调查：按照研究对象入选条件选择病例及对照，问卷调查尽量填写完整，准确，按10%的复查率进行质量控制。
病例选择：在当地收集病理诊断明确的原发性食管癌管着，未经放、化疗治疗，在淮安当地居住20年以上的汉族居民；病例应于术前或术后去的病理报告。
对照选择：与病例同性别、年龄相差±5岁、未患包括消化系统疾病在内的急、慢性疾病的健康个体的社区健康个体，对照应与病例无血缘关系，为在当地居住20年以上的汉族居民。