基因克隆步骤完整版.docx

1总 RNA 提取
液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1mlTrizol 加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；打开离心机预冷
加 200 μL 氯仿，振荡 15 s
1总 RNA 提取
液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将 1mlTrizol 加到离心管中待用
(2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置 5 min；打开离心机预冷
加 200 μL 氯仿，振荡 15 sec，室温放置 3 min，分层；
4oC，12,000g，离心 15 min；
取上清，加 500 μL异丙醇，混匀，室温放置 10 min；
4oC，12,000g，离心 10 min；
弃上清，加 1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用 100%乙醇
清洗
4oC，7,500g，离心 5 min；
弃上清，离心，用枪吸取多余液体， 放在超净台里干燥后， 加 50 μLDEPC
水，－ 80oC 保存。
此操作中所用到的器皿均需经过 DEPC 灭活 RNA 酶处理。提取的总 RNA
需经 RNA 电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。 OD260 值为核酸的吸收值， OD280 值为蛋白的吸收值， OD260/280 值在 - 间一般说明该核酸蛋白含量在允许的X围内，可正常使用；此外还有 OD230 值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸 OD260/230 值能达到 左右。 RNA 浓度计算公式：总 RNA 浓度（ μg/mL ） =A260×稀释倍数 ×40。
2 反转录 /cDNA 第一链的合成
纯化 RNA 以去除基因组 DNA ，操作按 TaKaRa公司的 PrimeScript RT reagent
with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为：
Total RNA
1μg
5×gDNA Eraser Buffer
2μL
gDNA Eraser
1μL
RNase Free dHO
补齐至 10μL
2
条件为： 42oC，2min；
RNA 纯化后，即可进行反转录。其体系为：
5×PrimeScript Buffer 2（ for Real Time）
4μL
PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ
1μL
RT Primer Mix
1μL
上一步的反应液
10μL
RNase Free dH2O
补齐至 μL
20
操作条件为：
(1) 37oC 放置 15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC 保存。
PCR
TaKaRa公司的 Premix Taq Version 操作，， PCR 反应体系如下：
Premix Taq
25μL
模板
5μL
引物 1 (10
μM)
1μL
引物 2 (10
μM)
1μL
ddH2O
18μL
PCR