高级生化实验报告三.doc

实验三 蛋白质分子量的测定 凝胶层析法
一、原理
凝胶层析法(即凝胶过滤法，gel filtration)是利用凝胶把分子大小不同的物质分离开的一种方法，又称为分子筛层析(molecular sieve chromatograp系数)代替Kd，其定义如下：
已知
Kd =（Ve-Vo）/Vi， Vt-Vo代替Vi，则：
Kav=（ Ve-Vo）/（Vt-Vo）
即 Ve = Vo+Kav(Vt-Vo)
这实际上是将原来以水作为固定相(Vi)改为水与凝胶颗粒Vt-Vo作为固定相．而洗脱剂(Ve-Vo)作为流动相。Kav与Kd对交联度小的凝胶差别较小，而对交联度大的凝胶差别大。
Ve与相对分子质量的关系：对同一类型的化台物，洗脱特性与组分的相对分子质量有关，流过凝胶柱时，按从大小顺序流出，分子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：
Ve=K1-K2logM
K1与K2为常数．M为相对分子质量。Ve也可用Ve-Vo（分离体积），Ve/Vo相对保留体积，Ve/Vt（简化的洗脱体积,它受柱的填充情况的影响较小）或Kav代替，与分子量的关系同上式，只是常数不同。通常多以Kav对分子量的对数作图得一曲线，称为“选择曲线”（如图2）。曲线的斜率是说明凝胶性质的一个很重要的特征。在允许的工作范围内，曲线越陡，则分级愈好，而工作范围愈窄。凝胶层析主要决定与溶质分子的大小，每一类型的化合物如球蛋白类，右旋糖酐类等都有它自己的特殊的选择曲线，可用以测定未知物的的分子量，测定时以便用曲线的直线部分为宜。
图2 球蛋白分子量“选择曲线”
用凝胶层析法测定蛋白质的分子量，方法简单，技术易掌握，样品用量少，而且有时不需要纯物质，用一粗制品即可。例如在一粗酶制剂中，为了测定某一酶组分的分子量，只要测定脱洗液中具有该酶最大活性的部分，然后确定其洗脱体积，即可从标准曲线中查出其分子量。凝胶层析法测定分子量也有一定的局限性，在pH6-8的范围内，线性关系比较好，但在极端pH时，一般蛋白质有可能因变性而偏离。糖蛋白在含糖量超过5%时，测得分子量比真实的要小。有一些酶底物是糖，如淀粉酶，溶菌酶等会与葡聚糖胶形成络合物，这种络合物与酶底物络合物相似，因此在葡聚糖凝胶上层析时表现异常，用凝胶层析法所测分子量的结果，要和其他方法的测定相对照，由此才可作出可靠的结论。
凝胶层析技术操作方便，设备简单，重复性好，而且条件温和，一般不引起生物活性物质的变化，目前已得到相当广泛的应用，例如可用于脱盐，浓缩高分子物质的溶液，生化物质的分离提纯，去除热原物质以及用于测定高分子物质的分子量。
二、试剂和器材
[试剂]
①标准蛋白质：蓝色葡聚糖-2000（200KD），牛血清血蛋白（67KD），胃蛋白酶（36KD），CytC()等，均为分析纯。
②洗脱液： Tris-HCl-KCl，
KCl 20ml， Tris 25ml， HCl ，再加H2O定容至100ml
③Sephadex G-75（或G-100）。
[器材]
层析柱：*40cm；核酸蛋白检测仪（或紫外分光光度计）；部分收集器；刻度试管。
三、操作步骤
1 凝胶柱的准备
凝胶的选择
凝胶的型号很多，型号不同，筛分范围不同。市售的Sephadex的分离范围，常用高聚糖或球蛋白测定。Sephadex G型一般适用于分离蛋白质，若用于分离核酸，则限于其空间结构和所带基团的影响，选用高于他们分子量范围的型号，或则选用适当型号的生物胶和Sephadex1。在去除蛋白质溶液中的盐类时，可选用凝胶Sephadex G-25。当溶液通过G-25柱时，蛋白质被排阻在凝胶外面先流出来，而盐类则扩散到凝胶网孔里后流出来，这样就使蛋白质得到纯化。一般来说，在规定的筛分范围内，混合物之间分子量差别越大，分离效果越好。
凝胶的处理
葡聚糖凝胶是以干粉保存的，因此使用前必须将干凝胶浸泡于将要用作洗脱剂的相同溶液中，充分溶胀后才能使用。根据层析柱的体积和所选用的凝胶，膨胀后的床体积，计算所需凝胶于粉的重量，将称好的干粉倾入过量的洗脱液中，一般多为蒸馏水、盐溶液或缓冲液，放置于室温，使之充分吸水溶胀。注意不要剧烈搅拌，以防颗粒破碎。浸泡时间根据凝胶交联度不同而异，为了缩短溶胀时间，可在100℃恒温水浴箱中加热溶胀，这样可大大缩短溶胀时间至几小时，而且还可杀死细菌和霉菌，排除凝胶内部包藏着的气泡。但是，必须避免置于酸或碱溶液中加热。
凝胶颗粒最好大小比较均匀，这样流速稳定，结果较好。如果颗粒大小不匀，可以在浸泡时用倾泻法将不易沉下的较细的颗粒倾