沉淀法提取蛋白子(共2页).doc

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实验四 沉淀法提取蛋白质
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实验四 沉淀法提取蛋白质
二、实验原理
沉淀是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。沉淀法操作简便，成本低廉，是分离纯化生物大分子，特别是制备蛋白质和酶时最常用的方法。其基本原理是根据不同物质在溶剂中的溶解度不同而达到分离的目的。不同溶解度的产生是由于溶质分子之间及溶质与溶剂分子之间亲和力的差异而引起的，溶解度的大小与溶质和溶剂的化学性质及结构有关，溶剂组分的改变或加入某些沉淀剂以及改变溶液的pH值、离子强度和极性都会使溶质的溶解度产生明显的改变。
在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是：⑴中性盐沉淀（盐析法）：多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。⑵有机溶剂沉淀：多用于蛋白质和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分离纯化。⑶选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。⑷等电点沉淀：用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。⑸有机聚合物沉淀： 是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作为沉淀剂。
在蛋白质溶液中加入大量的中性盐以破坏蛋白质的胶体稳定性而使其析出，这种方法称为盐析。因为中性盐的亲水性大于蛋白质和酶分子的亲水性，所以加入大量中性盐后，夺走了水分子，破坏了水膜，暴露出疏水区域，同时又中和了电荷，破坏了亲水胶体，蛋白质分子即形成沉淀。
蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入透析袋内，用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。
蛋白质在其等电点pH溶液中由于静电荷为零，同种电荷间的排斥作用消失，溶解度降低。氨基酸、蛋白质、酶和核酸都是两性电解质，可以利用此法进行初步的沉淀分离。由于许多蛋白质的等电点十分接近，而且带有水膜的蛋白质等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉淀析出，因此，单独使用此法分辨率较低，因而此法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀剂一起配合使用，以提高沉淀能力和分离效果。
本实验将根据这个原理，，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被用来从酪蛋白粗制剂中将脂类杂质除去，得到较纯的酪蛋白。酪蛋白在牛奶中的含量比较稳定，利用这一性质可以检测牛奶中是否掺假。
三、仪器与材料
烧杯（250ml、100ml）、玻璃棒、水浴锅、2ml、5ml、10ml移液管、离心机、磁力搅拌器、布氏漏斗、抽滤瓶、精密pH试纸或酸度计、表面皿、电子天平等。
盐析实验：饱和硫酸铵溶液、硫酸铵结晶粉末、卵清蛋白溶液500mL（5%卵清蛋白溶液或鸡蛋清的水溶液，新鲜鸡蛋清 ：水=1:1 ，然后用六层纱布过滤。）。
透析除盐实验：蛋白质的氯化钠溶液：三个除去卵黄的鸡蛋清与700ml水及