流感病毒的快速检测要求方法.docx

流感病毒的快速检测方法
一、RT-PCR快速诊断方法
（一）生物安全要求
（二）病毒核酸提取
（三）RT-PCR
（四）PCR产物纯化
（五）流感病毒RT-PCR检测引物
二、免疫荧光方法检测流感病毒
（一）原理
（二）标件仅共参考，如果引物更换，相应的反应条件需要做适当调整。
60C1min
42C10min
50c30min
95c15min
94C30sec
52C30sec
72C1min
返回第5部，循环34次
72C10min
4c保存
PCR产物检测
琼脂糖凝胶配置：%〜%溶液，加热使之完全溶解。冷却到50〜60c时加入澳化乙锭(EthidiumBromideEB,10ug/口，
PCR产物检测：将凝胶放入电泳槽，加入1kBEBuffer，使它淹没过胶面。每份标本取4/PCR产物，与1/5xLoadindpuffer充分混匀后全加入凝胶孔中。于同一凝胶的第一孔加入5仙分子量标准样品。加完样后，盖上电泳槽盖子，接通电源，稳压100v,电泳时间约30〜40min。
结果分析：用UV〜254暗箱式紫外透射仪观察电泳结果，在透射波长254nm下观察结果效果较好。或者用凝胶成像系统观察电泳结果。
注意事项：含EB的琼脂糖经处理后放入科研垃圾袋内统一处理。
含有EB的凝胶处理方法：
,小心混匀。
,小心混匀。于室温放置数小时。
,小心混匀后即可丢弃。
.二步法RT-PCR
⑴
实验材料
逆转录酶：AMVReverseTranscriptase,Catalog#M5101Paromeg
5xRTBuffer

Rnaseinhibitor40u/仙l(Promega)
上游引物200ng/口
下游引物200ng/口
无RNA酶的水(RnaseFreeWater)
Ex-Taq酶5u/lDRR001A250u(Takara)
10XPCRBuffer
⑵实验步骤
逆转录反应（在清洁区缓冲间，加RNA模板在核酸提取室）

xRTBuffer4al
.5mMdNTP2l
上游引物1口

逆转录酶1nl
RNA模板5口
总量：20/
将上述反应液混匀，42c水浴作用1小时。然后94c3min,放置冰上（下步PCR反应或-20C待用）
PCR反应配置（在清洁区缓冲问，力口cDNA模板应在PCR扩增室）

xPCRBuffer5口
5mMdNTP2l
上游引物1口
下游引物1口
Ex-
cDNA模板5口
总量：50111
将PCR反应管放入PCR扩增仪
PCR反应条件：此循环的反应条件仅共参考，如果引物更换，相应的反应条件需要做适当调整。
94C3min
94C40sec
52C40sec
72C2min
返回第2部，循环30次
72C7min
4c保存
PCR产物检测：同一步法
（四）PCR产物纯