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木瓜蛋白酶的固定方法
摘要：木瓜蛋白酶[ EC 3. 4. 22. 2 ]是一种重要的生化产品，在食品、医药工业中有广泛的用途, 还用于饲料、纺织及制革等领域[ 1 ] 。 由于木瓜蛋白酶价格昂贵并且无法重复利用,促使人们研究和制备固定化的活性仍然保持良好, 稳定性高,因此冷冻- 真空吸附可以作为一种新方法用于固定酶蛋白。
3　共价偶联法固定
共价偶联法:利用酶活性中心外的非必需基团与固相载体上的基团共价结合而制成固定化酶的方法叫共价偶联法,也叫共价结合法。共价结合法是目前研究最活跃的固定化方法之一。它的优点在于酶与载体结合牢固,不易脱落,可以连续使用较长时间。但也存在以下缺陷: (1) 在固定化过程中酶分子与载体分子之间发生直接(刚性) 碰撞,易使酶的构象改变,使酶失活; (2) 载体一般是疏水性物质,当酶直接被固定在疏水载体上时会改变酶的微环境,使酶蛋白构象发生折叠、失活; (3) 传统共价结合法得到的固定酶自由度低,酶分子和底物之间存在较大空间位阻,不利于保留酶游离态的均相催化活性。故称之为"刚性固定化"。
共价偶联法常用的载体有纤维素、葡聚糖、琼脂糖、甲壳素等。这里重点介绍几种比较新的共价偶联法固定木瓜蛋白酶。
3. 1　双醛淀粉柔性固定木瓜蛋白酶
针对共价偶联法存在的问题,有人想到了在载体表面接上短链(手臂分子) 进行酶的"手臂固定化"。但由于这种手臂链是分子量较小的短链,而且有些是碳链构成的疏水链,所以在固定化过程中,酶分子仍会受到较大的冲击力,使构象改变而失活。汪海萍、魏荣卿等[ 7 - 8 ]提出"柔性固定化酶"模型,即:在固定化载体上,接上一些有足够长度且是亲水的分子链,即所谓的"柔性链" ,而后再将酶结合到柔性链上,采用以下步骤实现木瓜蛋白酶的柔性固定化,见图1。
采用酶柔性固定化模型,选用壳聚糖、双醛淀粉制得的柔性载体(Chitosan - DAS50) ,对木瓜蛋白酶进行柔性固定化,所得的固定化酶活力回收率达72% ,相当于采用壳聚糖- 戊二醛(Chitosan - GA)手臂载体的3倍,柔性固定化木瓜蛋白酶使用7～8批次后仍保留一半的活力,储存稳定性也远远高于游离酶。
结果表明, "柔性固定化"方法不仅可减少酶在固定化过程中的失活,而且使所得到的固定化酶仍具有游离酶较高的均相催化活性。
图1　柔性固定化木瓜蛋白酶合成路线
　金属螯合载体定向固定化木瓜蛋白酶
金属螯合亲和层析( Immobilied metal ion affinitychromatography,简称IMAC) ,是利用金属螯合配体与蛋白质表面的供电子氨基酸- 组氨酸的咪唑基,半胱氨酸的巯醇基等(其中以组氨酸最为重要) 以配位作用紧密结合的原理,从而对蛋白质进行分离、纯化。
金属螯合载体对固定到表面的蛋白质构象影响小,且载体可以重复利用,若将这种技术应用于固定化酶,有望克服目前常用固定化载体和方法的一些不足。
刘琳琳等[ 10 ]以磁性金属螯合琼脂糖微球为载体,利用金属螯合配体( IDA - Cu2 + ) 与蛋白质表面供电子氨基酸相互作用的原理,定向固定木瓜蛋白酶。固定化最适条件为Cu2 + 1. 5 ×10- 2 mol/g 载体、固定化时间4h、固定化pH值7. 0、给酶量30mg/g载体。固定化酶的最适反应温度70