检测蛋白质与蛋白质.docx

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一、检测蛋白质与蛋白质相互作用①FRET技术〔invivo〕
FRET,Fluoresceneeresonanceenergytransfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白的N端段和C端段靠近结合，形成一个完整的泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记的片段降解，那么连接C端段的LexA-VP16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因的表达。
酵母三杂交的原理与双杂交一样，只是它研究的是两个蛋白和第三个成分间的相互作用，通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以是：蛋白、RNA或小分子，如下列图所示：
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如上图所示，在参加第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用，因此无法使BD和AD靠近，报告基因不能表达；当参加第三种成分后，蛋白X与蛋白Y的距离被拉近，BD和AD靠近，报告基因表达，从而可以被检测到。
③Pulldown技术〔invitro〕
Pulldown，即蛋白沉降技术，它是建立在蛋白质亲和层析的根底上的一种检测蛋白质间相互作用的分析方法。亲和层析的原理如下列图所示，不同蛋白对配体的亲和程度不同，因此可以先将非特异结合的蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去，只剩目的蛋白与层析柱结合，然后再用洗脱液将目的蛋白洗脱下来，到达纯化目的蛋白的作用。
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Pulldown技术利用的是亲和层析技术以及特异的配体〔如GSH或者镍〕。以下列图为例，将GST的基因与蛋白X的基因融合，表达出融合蛋白。将该融合蛋白的溶液过带有GSH配体的层析柱，那么这一融合蛋白就能结合在配体上，然后将待测蛋
白的溶液过柱，并让其与融合蛋白反响一段时间。
接着开始进行洗脱。如果待测蛋白与蛋白X无相互作用，那么在开始清洗的时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到的样品中发现待测蛋白〔以及蛋白X〕，说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用
④Farwesternblot〔invitro〕
Farwesternblot是基于westernblot开展而来，其原理如下列图所示。将样品蛋白用非变性的PAGE胶别离，然后转膜、封闭、洗膜，参加待测蛋白，使其与已在膜上的样品蛋白进行相互作用。接着参加带有标记〔如HRP〕的待测蛋白的抗体反响,
最后进行显色〔如参加HRP的底物〕，观察实验结果。
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4、加入挣制蛋白，让它与匚在睜上的蚩勻进衣曲互作用

⑤免疫共沉淀〔Co-IP〕〔invivo〕
免疫共沉淀是探测活体细胞内蛋白间的相互作用的一门技术。它的原理是当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质一蛋白质间的相互作用被保存了下来。如
果用蛋白X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内有相互作用的蛋白Y也能沉淀下来。
Co-IP的原理如下列图所示，首先从细胞中