实验室大致实验操作模式.ppt

实验室大致实验操作模式
紫杉醇生物合成的下游代谢途径
背景概况及目的
Date
基于RACE技术的同源性克隆方法克隆了南方红豆杉中的两个基因（MCT和MCS）
TcMCT和TcMCS基因的功能验证
TcMCT基因的原 66 67 Marker
研究结果与分析
Date
TcMCT重组蛋白含量测定
蛋白表达
考马斯亮兰法(Bradford法)测定重组蛋白含量
由此标准曲线，根据TcMCT蛋白测出的A595值，即可查出蛋白质含量。 。
研究结果与分析
Date
TcMCT重组蛋白的酶活性测定
蛋白表达
采用无机焦磷酸法测定酶活：反应在底物浓度充分，酶量固定的情况下反应体系在0-50min，OD值的变化量，绘制曲线计算出酶的活性为9(U/mg)。
研究结果与分析
Date
TcMCT重组蛋白在25℃下的CD图谱
用圆二谱色仪 (eireulardichroism, CD)在25℃下对TcMCT二级结构进行了测定结果为: α-%，β-sheet0%，β-turn 0%，random coil %。
%的α-螺旋、%β-折叠片、%β-%随意卷曲
蛋白表达
研究结果与分析
Date
组织差异表达
TcMCT基因的标准曲线图
18S基因的标准曲线图
研究结果与分析
Date
组织差异表达
TcMCT和18S基因的溶解曲线图
TcMCT和18S基因的扩增曲线图
研究结果与分析
Date
TcMCT在南方红豆杉中不同组织的表达水平
组织差异表达
研究结果与分析
Date
D
D
TcMCS基因的获得
基因克隆
研究结果与分析
Date
TcMCS全长cDNA序列的分析
TcMCS全长为1081-bp，包含一段长度为744bp的ORF及一段长度为16-bp的5-端非编码区和321-bp的3’端非编码区
编码一个由247个氨基酸残基组成的蛋白质

等电点 (pI)
基因克隆
研究结果与分析
Date
TcMCS 全长cDNA序列及编码的氨基酸序列
质体转运肽
基因克隆
研究结果与分析
Date
TcMCS蛋白质的二级结构预测
h表示α-螺旋，e表示片层，t表示β-折叠，c表示随意卷曲
TcMCS包含26%的α-螺旋、23% β-折叠片、7%β-转角和44%随意卷构成
基因克隆
研究结果与分析
Date
“★”表示底物结合的活性位点
TcMCS氨基酸序列多重比对
基因克隆
TcMCS分别与Taxus media MCS((% identity) 、 Cephalotaxus fortunei ( % identity) 、Ginkgo biloba MCS (%identity)和Arabidopsis thaliana MCS (% identity)具有很高的同源性。
研究结果与分析
Date
TcMCS系统进化树
裸子植物来源的MCSs用〇表示，被子植物用表示，细菌用▲表示，分支上的数字为Bootstrap值(重复1000次)。
基因克隆
研究结果与分析
Date
TcMCS蛋白质三级结构预测
α-螺旋用红色螺旋表示，β-片层用黄色板状箭头表示，随机卷曲用绿色绳状表示。活性位点的残基(His79、His208、Asp212、Ser213、Glu216、Arg218、His223）在图上标注
基因克隆
TcMCS 单体
结构图
TcMCS行使功能和晶体堆积时均以三聚体形式存在，即三个亚基的β-折叠片面对面形成类β桶结构，α-螺旋包裹在亚基的外围。
研究结果与分析
Date
TcMCS基因的功能验证
利用携带有pAC-BETA质粒的大肠杆菌菌株XL1-Blue来验证TcMCS蛋白的功能，通过转入携带有TcMCS基因的pTrc质粒， TcMCS在大肠杆菌中超表达，与pAC-BETA共同推动代谢流往下游流动，生产黄色的类胡萝卜素。
TcMCS基因的功能验证
功能验证
研究结果与分析
Date
结论与展望
（1）首次从南方红豆杉中克隆出紫杉醇前体代谢途径中两个基因MCT 和MCS全长cDNA，对其进行了详尽的生物信息学分析；
（2）原核表达TcMCT蛋白，Ni-NTA柱亲和层析获得约35KD的TcMCT重组蛋白。用圆二色谱仪对TcMCT进行二级结构测定，该重组蛋白中含有α-he