酶解与超声波辅助提取白藜芦醇工艺优化及其含量的HPLC测定.doc

酶解与超声波辅助提取白藜芦醇工艺优化及其含量的HPLC测定
作者:

摘 要:建立超声波辅助酶法提取葡萄皮渣中白藜芦醇的有效工艺及其含量的HPLC测定方8(250× mm,5 μm) ;FA1224S电子天平(德国赛多利斯);超纯水纯化系统(南京易普易达);超声清洗器(昆山超声);旋转蒸发仪(上海爱朗仪器);超声波萃取仪(宁波新芝生物);旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。
实验材料及试剂
葡萄皮渣(由购自大润发超市的葡萄制得):葡萄取皮,将葡萄皮干燥粉碎后,使用60目筛进行过筛;纤维素酶(酶活力:500 000 U/g,浙江一诺生物科技有限公司);白藜芦醇标准品(sigma公司);甲醇、无水乙醇、冰醋酸:购自广州西陇化工有限公司,均为分析纯;超纯水为实验室自制所得。
實验方法
白藜芦醇提取物制备
(1)白藜芦醇提取物制备流程
称取1 g葡萄皮粉于100 mL锥形瓶,加入适量纤维素酶及水进行酶解。pH=5,酶解时间 h,酶解温度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇,将超声波的功率设置为400 W,超声波处理30 min,超声波处理后于75 ℃提取4 h。采用6 000 r/min离心提取液15 min,取上层清液减压蒸馏,得白藜芦醇提取物。 (2)白藜芦醇制备工艺筛选
应用单因素优选法,分别筛选出酶解温度、超声波处理时间、料液比、提取时间、提取温度。
酶解温度:取粉末适量, mg/g的纤维素酶,pH=5,酶解时间 h,设置酶解温度分别为45、50、55、60、65 ℃,而后按照制备流程提取白藜芦醇。
超声波处理时间:超声波功率设置为400 W,处理时间分别设置为10、20、30、40、50 min,按制备流程进行提取。
料液比:设置料液比为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶49,按制备流程进行提取。
提取时间:、3、、4、 h,按制备流程进行提取。
提取温度:设置提取温度为60、65、70、75、80 ℃,按制备流程进行提取。
根据提取所得白藜芦醇含量筛选出适宜的酶解温度、超声波处理时间、料液比、提取时间及提取温度。单因素实验中,白藜芦醇含量测定采用紫外分光光度法,Y= 2X- 5,R 2= 2, ~ μg/mL。
(3)提取工艺优化
采用L9 ( 34 ) 表进行正交试验,因素水平见表 1,评价指标为提取物中白藜芦醇的含量,以此优化从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的工艺。
(4)不同提取方法的比较
为进一步考察超声波对从葡萄皮渣中提取白藜芦醇的效果,在上述实验的基础上,采用4种不同的提取方法,比较其所提取的白藜芦醇含量。
方法1:称取葡萄皮粉,按料液比1∶35加入80%乙醇,于75 ℃提取4 h。
方法2:称取葡萄皮粉,加入纤维素酶及水适量进行酶解。pH=5, h,酶解温度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇,于75 ℃提取4 h。
方法3:称取葡萄皮粉,按料液比1∶35加入80%乙醇,超声波的功率400 W,超声波处理30 min,超声波处理后于75 ℃提取4 h。
方法4:称取葡萄皮粉,加入纤维素酶及水适量进行酶解。pH=5, h,酶解温度55 ℃。酶解后按料液比1∶35加入80%乙醇,超声波功率400 W,超声波处理30 min,超声波处理后于75 ℃提取4 h。
白藜芦醇含量的HPLC测定
(1)色谱条件
色谱柱:Agilent TC-C18(250× mm,5μm);流动相为1%甲醇-1%冰醋酸(35∶65);进样量为20 μL; mL/min;柱温为35 ℃;检测波长为305 nm。
(2)工作曲线的建立
对照品溶液的制备:精密称取白藜芦醇标准品, mg/mL的对照品溶液。精密量取对照品溶液, 5、、 5、 0、 mg/mL的对照品溶液。
,记录相应色谱峰峰面积,以对照品质量(μg)为横坐标,相应峰面积值为纵坐标绘制标准曲线,得回归方程为Y=9 +,r= 5,白藜芦醇含量在26 ~ 5 320 μg范围内线性关系良好。