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第三节蛋白质结构
2. 肽的结构
氨基末端
（N末端）
羧基末端
（C末端）
肽键
肽键
肽键
结构通式
8
肽的命名(nomination)：
如：Val-Ala-Lys-Gly-Arg
氨基酸测定
羧基末端---羧肽酶法
31
用LiBH4使C末端氨基酸还原成氨基醇，然后水解，测定氨基酸，即可知C末端氨基酸。
羧基末端基氨基酸测定
羧基末端---硼氢化锂还原法
-------------
H2N-CH-CO-NH-CH-COOH
H2N-CH-CO-NH-CH-CH2OH
LiBH
4
|R1
|R2
|R1
|R2
32
（2）测定步骤
。
蛋白质一级结构的测定
33
(2) 测定步骤
。
几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).
蛋白质一级结构的测定
34
(2) 测定步骤

还原法:-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基.
SH-CH2-CH2-OH
蛋白质一级结构的测定
35
(2) 测定步骤
氧化法:应用过甲酸氧化法拆分多肽链间的二硫键。
蛋白质一级结构的测定
36
（2）测定步骤

根据蛋白质水解
蛋白质一级结构的测定
完全水解（彻底水解）
不完全水解（部分水解）
水解产物是aa 混合物
水解产物是各种大小不同的肽段和aa
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水解方法
反应条件
产物
优点
缺点
酸水解
6M HCl 或4M H2SO4
共煮20hrs
L-aa
不引起消旋
Trp被破坏；一部分羟基aa (Ser,Thr) 被分解；Asn 和Gln 的酰胺基被水解下来
碱水解
5M NaOH
共煮20hrs
L-aa 和D-aa混合物
不破坏Trp
引起消旋；
Arg 脱氨基生成鸟氨酸
酶水解
生理温度、pH
肽段和氨基酸混合物
不破坏aa
不引起消旋
酶解时间长
Table1-2
38
（2）测定步骤

蛋白质一级结构的测定
多肽链断裂法：酶解法和化学法
39
酶解法:
胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶
多肽链的选择性降解
（2）测定步骤
40
Trypsin ：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。
肽链
水解位点
胰蛋白酶
-HN-CH-CO-NH-CH-CO-
R1
R2
41
或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。
R2=Pro 水解受抑。
肽链
水解位点
糜蛋白酶
42
Pepsin：R1和R2＝Phe, Trp, Tyr; Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。
R1=Pro 水解受抑。
肽链
水解位点
胃蛋白酶
43
thermolysin：R2=Phe, Trp, Tyr; Leu，Ile, Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。
R2=Pro或Gly 水解受抑。
R1或R3=Pro 水解受抑。
肽链
水解位点
嗜热菌蛋白酶
44
谷氨酸蛋白酶： R1=Glu、Asp(磷酸缓冲液); R1=Glu (碳酸氢铵缓冲液或醋酸缓冲液)
精氨酸蛋白酶： R1=Arg
肽链
水解位点
谷氨酸蛋白酶和精氨酸蛋白酶
45
化学法：可获得较大的肽段
溴化氰(Cyanogen bromide)水解法。
羟胺（NH2OH）：
多肽链的选择性降解
（2）测定步骤
46
（2）测定步骤
。
蛋白质一级结构的测定
47
Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法。
Edman氨基酸顺序分析法
苯乙内酰硫脲- 氨基酸（PTH-aa）
苯氨基硫甲酰氨基酸
（2）测定步骤
48
（2）测定步骤

对角线法
蛋白质一级结构的测定
49
对角线电泳（diagonal eletrophoresis）
（Brown 和 Hartly）
50
51
+
-
+
-
第二向
第一向
a
b
Brown和Hartlay对角线电泳图解

图中a、b两个斑点是
由一个二硫键断裂
产生的肽段