流式细胞仪结果分析.ppt

流式细胞仪结果分析
本讲稿第一页，共七十六页
第一节 概述
一、工作原理
二、散射光的测定
三、荧光测量
四、细胞分选原理
第二节 数据的显示与分析
一、参数
二、数据显示方式
三、设门分析
激光
自然光、灯光
对象
细胞、生物粒子
细胞、组织等
承载工具
鞘液及流动室
载玻片
检测信号
光学信号
形态及染色
放大方式
PMT、放大电路
目镜×物镜、光学放大
统计
计算机，>5000
人工，200
结果
多参数，综合分析
简单，单参数
流式细胞仪与显微镜的区别
本讲稿第十九页，共七十六页
细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。
二、散射光的测定
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前向散射光（forward scatter, FS）：激光束照射细胞时，光以相对轴较小角度(°～10°)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。
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FALS Sensor
Laser
前向散射光示意图
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侧向散射光（side scatter, SS）：激光束照射细胞时，光以90°角散射的讯号，用于检测细胞内部结构属性。
本讲稿第二十四页，共七十六页
FALS Sensor
90LS Sensor
Laser
侧向散射光示意图
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测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。
此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。
淋巴细胞
单核细胞
中性粒细胞
光散射测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群
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荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同。
每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。
选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。
线性放大器和对数放大器
三、荧光测量
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荧光染料的特性
激发波长(EXCITING)
发射波长(EMISSION)
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荧光补偿
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通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。
四、细胞分选原理
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细胞悬液形成液流柱
流动室振动
液流断裂成液滴
空白液滴
含细胞的液滴
弃去
偏转落入收集器
压电晶体
产生机械振动
不充电
充电
（一）分选基本原理
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分选速度：单位时间内分选的细胞数量。与悬液中细胞的含量成正比。
分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。
分选收获率：实际收获的分选细胞与设定通过测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。
分选得率：从一群体细胞悬液中分辨出目的细胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。
（二）分选的技术要求
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参数：FS,SS,FL
数据显示方式 （单参数直方图 、双参数散点图 、二维等高图 、假三维等高图 、三参数散点图 ）
设门分析技术
第二节 数据的显示与分析
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FS：反映颗粒的大小
SS：反映颗粒的内部结构复杂程度
FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少
一、 参数
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单参数直方图
双参数直方图:点图
二维等高图
假三维等高图
三参数直方图
多参数分析
直分析方图
设门分析:REGION和GATE设置
二、数据显示方式
本讲稿第三十六页，共七十六页
由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。
（一）单参数直方图
本讲稿第三十七页，共七十六页
单参数直