高效液相色谱法 (4).ppt

高效液相色谱法
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本讲稿第一页，共三十九页
高效液相色谱法的主要类型和原理
高效液相色谱法的固定相和流动相及其选择
高效液相色谱仪
高效液相色谱分析方法
Introduction
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本讲稿第二页，共三十九页
H子的非极性部分与固定相上的烃基间产生疏溶剂缔合
溶质的极性部分受到极性流动相的解缔合作用，使它离开烃基
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b. 保留行为的主要影响因素
溶质的分子结构
溶质的极性越弱，其疏水性越强，k越大，tR也越大；
同系物中，碳数越多，k越大
流动相
流动相的极性增大，洗脱能力降低；有机溶剂含量增加，k值变小
流动相的pH变化会改变溶质的离解程度，离解程度越高，k值越小
流动相中加入中性盐，表面张力变大，使中性溶质的k增大
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例：固定相：C18
流动相：甲醇:水 ( 20:80)
某组分的tR=20min , 如何 使tR减小？
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离子抑制色谱法
（ion suppression chromatography; ISC）
通过调节流动相的pH，抑制有机弱酸、弱碱的离解，增加它与固定相的疏水缔合作用，以达到分离的色谱法
样品为弱酸，降低流动相的pH，k增大，tR增大；
样品为弱碱，提高流动相的pH，k增大，tR增大；
注意流动相的pH值不能超过键合相的允许范围
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固定相
碳链越长，疏水性越强，k增大
链长一定时，硅胶表面键合烷基的浓度越大，k越大
键合基团的链长和浓度还影响分离的选择性
应用：
非极性及中等极性的分子型物质。
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定义：离子对试剂加入极性流动相中，样品离子与反离子生成中性离子对，使样品的K增加，改善分离效果。
(3) 反相离子对色谱法
paired ion chromatography, PIC
ion pair chromatography, IPC
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阴离子分离：酸类或带负电荷的物质，常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；
阳离子分离：碱类或带正电荷的物质，常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；
a. 离子对试剂：
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b. 分离机制：
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c. 影响保留因子的因素：
离子对试剂的种类和浓度
离子对试剂碳链长度增加，组分的k增大，tR增大
离子对试剂浓度较低时，试剂浓度升高，k增大，然后趋于稳定
采用长链离子对试剂时，当离子对试剂浓度超过一定值时，试剂浓度升高，k减小
流动相
流动相极性增大，组分的k增大，tR增大
试样组分与离子对试剂全部离子化时，组分的k值最大
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优点：
易实现：ODS柱，甲醇-水，离子对试剂。
可避免缓冲液对流路的腐蚀（IEC）
缺点： PIC试剂价格贵。
用途：生物碱、有机酸、磺胺类药物等。
d. 优缺点与用途：
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3. 其它高效液相色谱法
(1) 离子色谱法 ion chromatography
离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一种技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。
抑制型（双柱型）离子色谱法
非抑制型（单柱型）离子色谱法
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方法原理
分离柱，交换反应：
洗脱反应：
抑制柱：与组分反应：
与洗脱剂反应：
低交换容量的阴离子交换剂
高交换容量的阳离子交换剂
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手性固定相
流动相中加入手性添加剂
用途：
分离、分析立体异构体
(2) 手性色谱法：chiral chromatography, CC
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(3)亲和色谱(AC) Affinity chromatography
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。
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(4)排阻色谱
size- exclusion chromatograp